本发明专利技术涉及微生物工程技术领域，提供了一种重组表达木聚糖酶的毕赤酵母工程菌及其应用。所述工程菌携带有能表达瘤胃真菌的木聚糖酶基因的表达载体，其重组表达的木聚糖酶在酸性偏中性范围内具有较高的酶活性，最适作用pH为6.0，在pH5.0-7.5的范围内能保持80%以上的活性，最适反应温度为50℃，在温度40-60℃的范围内，能保持50%以上的活性。本发明专利技术的木聚糖酶可广泛应用于烘培食品加工领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种木聚糖酶及重组表达木聚糖酶的毕赤酵母工程菌。
技术介绍
阿拉伯木聚糖也叫戊聚糖或木聚糖，它的主要成分为阿拉伯糖和木糖。根据阿拉伯木聚糖是否溶于水，分为水不可溶性阿拉伯木聚糖和水溶性阿拉伯木聚糖。谷物中一般含有5% 10%的细胞壁物质，这些细胞壁物质主要由非淀粉多糖(NSP)组成。而在NSP中，阿拉伯木聚糖占主要部分(一般占谷物)的6. 5% 12.2%，虽然阿拉 伯木聚糖在谷物中的含量通常不高，但它却是构成植物细胞壁的重要成分。阿拉伯木聚糖是小麦细胞壁的主要结构性多糖，具有高黏度、高分子量和氧化胶凝等物化特性，与其他非淀粉多糖(3-葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、纤维素和木质素等)一起共同构成了小麦各组织的细胞壁，成为细胞骨架的重要组分。面粉中存在着非淀粉多糖、戊聚糖，主要是阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖肽，其中阿拉伯木聚糖占戊聚糖60% 70%。一般小麦含阿拉伯木聚糖约2%，其中水溶性的为0.5% 0. 8%，水溶性戊聚糖的持水力很强，一般能吸水达10 20倍。在面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能增加面团的持水性。试验证明，在面粉中添加木聚糖酶，能使不溶性阿拉伯木聚糖增溶、改进面团的机械强度和增加面包的体积、改进面包的色泽。一般情况下，面粉中存在着内源酶，能使15% 20%的不溶性戊聚糖溶解。但加入外来的酶，可使溶解量增至40% 65%。木聚糖酶是一种专一性的戊聚糖酶。作用于面粉中的可溶及不可溶性的戊聚糖，木聚糖酶对水不溶性戊聚糖起到增溶效果，一定程度上减小了水不溶性戊聚糖的消极影响，吸水性强，可增强蛋白质膜的强度和弹性，可以提高面筋的弹性，增强对过度搅拌的耐受力，改善面团的可操作性及稳定性，在烘烤时降低二氧化碳的扩散速度，气体分布均匀，大小和稳定性都有所改善。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种木聚糖酶及重组表达木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，即利用基因工程技术手段，将瘤胃真菌(Orpinomyces)的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株。该菌株能高效表达木聚糖酶，且生产的木聚糖酶在酸性偏中性条件下具有较高的活性，能有效提高面团的延伸性和发酵性能，可广泛应用于烘培领域。本专利技术的木聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。用于编码上述木聚糖酶的核苷酸，其一种序列为SEQ ID NO :2。本专利技术涉及一种毕赤酵母工程菌，为毕赤酵母El (Pichia pastoris El),该工程菌携带有能表达瘤胃真菌木聚糖酶基因的表达载体，已于2012年11月27日，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为=CCTCC NO M 2012481。本专利技术另一方面涉及上述毕赤酵母工程菌的应用，用于生产木聚糖酶，所述木聚糖酶在酸性偏中性条件下适用。本专利技术另一方面涉及上述木聚糖酶在烘焙中的应用。本专利技术构建了高效表达瘤胃真菌木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌，其生产的木聚糖酶在酸性偏中性范围内具有较高的酶活性，最适PH值为6.0，在PH5. 0-7. 5的范围内能保持80%以上的活性；最适反应温度为50°C，在温度40-60°C的范围内，能保持50%以上的活性。本专利技术的重组表达木聚糖酶能有效提高面团的延伸性和发酵性能，可广泛应用于烘培领域。 附图说明图1 :木聚糖酶基因XynEl的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。图2 :构建的重组表达载体pPIC9K_XynEl示意图。图3 :毕赤酵母工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳图，箭头所示为重组木聚糖酶XYNEI。图4 :重组木聚糖酶XYNEl的发酵曲线。图5 :重组木聚糖酶XYNEl的pH特性分析。图6 :重组木聚糖酶XYNEl的反应温度分析。具体实施例方式下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克' 实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，本专利技术的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例1、瘤胃真菌木聚糖酶基因的克隆查阅GenBank中的基因序列，找到糖苷水解酶11家族中的一个木聚糖酶基因，该基因来源于瘤胃真菌(Orpinomyces) ,GenBank号为AAD04194.1。通过上海捷瑞生物工程有限公司合成该木聚糖酶基因，命名为XynEl，合成基因的基因序列为SEQ ID NO. 2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。采用PCR反应克隆木聚糖酶基因XynEl片段，引物和反应条件如下引物I (F) GCGCGAATTCAAGGCCCAATGGGGTGGAAACG引物2 (R) TAAAGCGGCCGCTTAAGAGGGAGCAGAACC反应条件为94°C变性5min ;然后94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸45s，30个循环后，72°C保温lOmin。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖电泳结果如图1所示，XynEl基因为大小720bp的片段。实施例2、重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌的构建1、表达载体的构建将克隆得到的木聚糖酶基因XynEl片段，用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，100 ill酶切体系如下木聚糖酶基因XynEl PCR产物40 ylUOXH buffer IOu I,IOXBSA IOu UEcoR I 5u l.Not I 5u UddH2O 30u I0 37°C酶切 4h 后，琼脂糖凝胶电泳回收。将表达载体pPIC9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，100 酶切体系如下表达载体 PPIC9K 20 ii 1、10XH buffer IOu l.EcoR I 5u l,ddH2 065 u I0 37°C酶切 4h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，IOOiU酶切体系如下pPIC9K 回收片段 20 ii l、10XHbuffer IOu 1U0XBSA IOu IUOXTriton IOy1、Not I 5 u UddH2O 45 yl。37°C酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将经EcoR I和Not I双酶切的XynEl片段与表达载体pPIC9K相连接，构建表达载体pPIC9K-XynEl，如图2所示。连接体系如下:表达载体pPIC9K 5 iil、XynEl片段3 yl、IOXT4 ligase buffer Iu UT4 ligase I 。22C 连接过夜，转化到大肠杆菌 DH5 a，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB液体培养基中，37°C过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-XynEl。2、转化与筛选将重组酵母表达质粒pPIC9K_XynEl用Sal I进行线性化，线性化片段用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。3、发酵验证挑取单个阳性转化子转接于BMGY培养基中，30°C，250rpm振荡培养Id后，再转入BMM本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种木聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖志壮，徐晓东，李冬冬，王海，刘安邦，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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