一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白及生产方法技术

本发明专利技术公开了一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白及其生产方法，该方法主要包括以下步骤：(1)克隆PCP基因；(2)构建真核表达载体并转化其到真核酵母宿主中；(3)通过筛选，得到高水平分泌表达的酵母转化子，酵母表达的PCP存在糖基化和非糖基化的两种形式；(4)利用摇瓶扩大培养，培养液上清经透析后经镍亲合层化得到高纯度的糖基化和非糖基化的PCP蛋白；(5)将纯化的重组PCP蛋白加入到培养的不同肿瘤细胞系中，该重组蛋白对骨肉瘤细胞U2OS、胃癌细胞MGC803等细胞株具有选择性抗肿瘤细胞活性。本发明专利技术首次利用毕赤酵母表达系统表达了具有选择性抗肿瘤细胞活性的一种新的茯苓免疫调节蛋白PCP，该方法既可以大量生产活性PCP蛋白，又为肿瘤的治疗增加了一种新的重组蛋白。

Poria cocos PCP protein with selective anti-tumor cell activity and production method thereof

The present invention discloses Fuling PCP protein the antitumor activity of a selective and a production method thereof. The method comprises the following steps: (1) PCP (2) gene cloning; eukaryotic expression vector was constructed and transformed into the eukaryotic yeast host; (3) through screening, a high level expression in yeast the expression of PCP in yeast transformants, there are two kinds of forms of glycosylated and non glycosylated; (4) using shake flask culture expansion, supernatant after dialysis by nickel affinity layer of glycosylated and non glycosylated PCP protein with high purity; (5) will be purified the recombinant PCP protein was added to different tumor cell lines in culture, the recombinant protein has selective antitumor activity on human osteosarcoma cells U2OS and MGC803 in gastric cancer cell lines. The invention uses the Pichia expression a new Fuling selective antitumor activity of immune regulatory protein PCP expression system for the first time, the method can produce large amounts of activated protein PCP, added a new recombinant protein for tumor treatment.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物的技术，特别涉及一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白及生产方法。
技术介绍
茯苓是中国的道地、大宗药材。茯苓因其性平、味苦、无毒，具有渗湿利水、防癌抗衰、增强机体免疫力的功效，被称为中国的四大原料药之一，临床中药处方中65％都有茯苓，也是当前国际药品市场最具潜力的天然药物之一。同时被国家卫生部、国家中药管理局列入“既是食品又是药品的品种名单”。茯苓中的主要成分为膳食纤维，其比例占茯苓干重的80％以上；其次为蛋白质，约占茯苓干重的1.5％。目前，对茯苓活性成分的研究主要集中在非蛋白类的次生代谢产物上。茯苓有效成分的研究中，研究得最多的就是茯苓多糖，即茯苓次聚糖，它具有抗肿瘤活性，其衍生物羧甲基茯苓糖已被证明具免疫促进及抗肿瘤作用，而U-茯苓多糖和羟乙基茯苓多糖则可抑制小鼠肉瘤细胞生长、调节免疫系统功能；其次是茯苓的三萜类化合物，可抑制癌细胞增生，目前的研究发现茯苓三萜类化合物还具有抗炎、抗肿瘤细胞生成及诱生集落刺激因子等作用。目前，对占茯苓干重1.5％的茯苓蛋白的研究几乎没有报道。国立台湾大学的研究者从茯苓干燥菌核中经由阴离子交换树脂与胶体过滤层析纯化得到一种免疫调节蛋白FIP。体外试验显示该茯苓蛋白FIP能刺激RAW264.7巨噬细胞产生TNF-α与IL-1β，同时亦能调控NF-κB相关基因的表达量。另外，不少研究者也从其它食用和药用真菌中分离纯化到了多种类似功能的蛋白。因此，茯苓中也可能存在多种具有免疫调节功能的蛋白，利用基因工程技术，大量生产这类蛋白并对其生物活性进行开发，将为整个茯苓及其制品产业的开发提供新的思路和新的产品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白及生产方法，并开发其独特的生物功能，根据该方法可获得稳定、高效分泌表达rPCP的毕赤酵母转化子并有效纯化到了不同糖基化修饰的蛋白，该重组蛋白具有选择性抗肿瘤细胞活性；利用该专利技术陈述的方法，可保证得到的一种新的重组功能蛋白。解决上述目的的技术方案如下：一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，该蛋白具有选择性抗肿瘤细胞活性。进一步的，该蛋白包括糖基化修饰和未经糖基化修饰两种形式。一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白的生产方法，步骤如下：1)、克隆茯苓免疫调节蛋白PCP基因：以新鲜茯苓菌核为材料，先用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出茯苓免疫调节蛋白PCP，所用特异引物上游引入XhoI酶切位点、在下游未端引入XbaI酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pUC载体，得质粒PCP/pUC，经过测序确定为正确表达序列；2)、构建真核表达载体：将酵母分泌表达载体和质粒PCP/pUC分别经过XhoI及XbaI双酶切并纯化回收，利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pPICZαA/PCP；3)、转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZαA/PCP用SacI单酶切线性化后，用电击转化法转入毕赤酵母中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆；4)、高水平分泌表达酵母转化子的筛选：阳性克隆转接至含有500μg/mLZeocin的YPD平板，筛选到了Zeocin抗性的转化子；将所述Zeocin抗性的转化子利用YPD液体培养基洗下，经稀释后，涂布到2000μg/mLZeocin的YPD平板，得到高抗性转化子，再以BMGY培养基培养至光密度值>10.0，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，诱导72小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rPCP酵母转化子；5)、诱导后的酵母转化子上清液离心，收集离心后的上清液，20mMTrispH8.0透析后，镍亲合纯化层析法纯化目标蛋白，纯化蛋白经PBS透析后，利用超滤法浓缩收集到的蛋白，最后得到纯度达95％以上的重组PCP蛋白；6)、将纯化的重组蛋白加入到培养的不同肿瘤细胞系中，该重组蛋白对骨肉瘤细胞U2OS、胃癌细胞MGC803细胞株具有选择性抗肿瘤细胞活性。进一步的，步骤1中包含XhoI和XbaI酶切位点的特异性引物为：上游引物GCCTCGAGAAAAGATTCGTCTCTCCTAGTAGCGCAC；下游引物GCTCTAGATCTAGAGCATGAGCGGCCCCCACAG。进一步的，步骤3中所述的表达载体为分泌型表达载体、表达菌株为毕赤酵母所有宿主菌。进一步的，步骤3中所述的表达载体为pPICZαA、表达菌株为X33菌株。进一步的，步骤6中所述的不同肿瘤细胞系具体为人肺癌细胞系H1299、人胃癌细胞系A549、人骨肉瘤细胞U2OS、人胃癌细胞MGC803。进一步的，步骤6具体为将纯化的重组蛋白加入到培养的人肺癌细胞系H1299、人胃癌细胞系A549、人骨肉瘤细胞U2OS、人胃癌细胞MGC803细胞系中，于37℃，5％二氧化碳培养箱中，用含10％胎牛血清的DMEM为培养基培养至细胞密度为90％，胰酶消化后用含10％胎牛血清的DMEM将细胞浓度调节至约为106/ml，24孔培养板中，分别加入上述细胞，每孔加入2ml，37℃，5％二氧化碳培养箱中将细胞培养12小时，将纯化的重组蛋白以终尝试为1ng/ml加入到上述长有不同细胞的24孔培养板中，37℃，5％二氧化碳培养箱中将细胞培养36小时，显微镜下拍照，结果表明：该重组蛋白对骨肉瘤细胞U2OS、胃癌细胞MGC803等细胞具有选择性抗肿瘤细胞活性而对人肺癌细胞系H1299、人胃癌细胞系A549未见生物活性。选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白在肿瘤治疗及肿瘤治疗药物方面的应用。本专利技术所述蛋白为于初夏时节，气温在20℃左右，从栽种1年的明显可以观察到茯苓菌核已长成的土壤中采集鲜茯苓菌核，立即用自来水将鲜茯苓洗干净、去皮，切成薄片后并立即加入液氮中保存，之后经提取得到。用本专利技术所述的生产rPCP的高水平表达酵母转化子及其分离纯化不同程度糖基化修饰形式的蛋白方法具有显著的优势：一方面，它能够防止宿主菌对表达产物的降解、减轻宿主细胞代谢的负荷以及表达产物对宿主的毒性作用；二是能够促进分泌蛋白按适当的方式折叠、恢复其天然构象；三是摸索出一条有效纯化具有生物活性、存在不同糖基化修饰程度的rPCP蛋白的方法；四是测定了毕赤酵母表达rPCP的生物活性，测定结果表明：毕赤酵母表达的不同程度糖基化修饰的rPCP蛋白在极低浓度下(1ng)表现出极高对骨肉瘤细胞U2OS、胃癌细胞MGC803等细胞株具有选择性抗肿瘤细胞活性。本专利技术探索出用真核宿主毕赤酵母高效表达和纯化rPCP蛋白的方法，既保证了rPCP的生物学活性，也高效地获得了大量稳定蛋白。该方法将毕赤酵母中分泌表达的不同糖基化修饰程度的rPCP蛋白全部纯化下来，得到的产物经生物活性测定表明重组蛋白具有未曾报道的选择性抗肿瘤细胞生物学活性。附图说明图1，真核表达载体pPICZαA/PCP构建示意图；图2，摇甁条件下，毕赤酵母表达的rPCP各时段SDS-PAGE电泳分析示意图；图3，rPCP镍亲合纯化条件下，不同浓度咪唑洗脱样品的SDS-PAGE电泳分析示意图；图4，rPCP生物学本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：该蛋白具有选择性抗肿瘤细胞活性。3.根据权利要求1所述茯苓PCP蛋白，其特征在于，该蛋白包括糖基化修饰和未经糖基化修饰两种形式。4.一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白的生产方法，其特征在于：步骤如下：(1)克隆茯苓免疫调节蛋白PCP基因：以新鲜茯苓菌核为材料，先用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出茯苓免疫调节蛋白PCP，所用特异引物上游引入XhoI酶切位点、在下游未端引入XbaI酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pUC载体，得质粒PCP/pUC，经过测序确定为正确表达序列；(2)构建真核表达载体：将酵母分泌表达载体和质粒PCP/pUC分别经过XhoI及XbaI双酶切并纯化回收，利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pPICZαA/PCP；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZαA/PCP用SacI单酶切线性化后，用电击转化法转入毕赤酵母中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆；(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：阳性克隆转接至含有500μg/mLZeocin的YPD平板，筛选到了Zeocin抗性的转化子；将所述Zeocin抗性的转化子利用YPD液体培养基洗下，经稀释后，涂布到2000μg/mLZeocin的YPD平板，得到高抗性转化子，再以BMGY培养基培养至光密度值>10.0，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，诱导72小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rPCP酵母转化子；(5)诱导后的酵母转化子上清液离心，收集离心后的上清液，20mMTrispH8.0透析后，镍亲合纯化层析法纯化目标蛋白，纯化蛋白经PBS透析后，利用超滤法浓缩收集到的蛋白，最后得到纯度达95％以上的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪波，吴东海，
申请(专利权)人：怀化学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43