一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的嗅觉活性剂筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法包括以下工艺步骤：1)提取中华蜜蜂工蜂采集蜂触角总RNA；2)设计中华蜜蜂气味结合蛋白基因引物，通过RT‑PCR获得中华蜜蜂气味结合蛋白基因全长；3)构建中华蜜蜂气味结合蛋白基因的原核表达载体；4)通过IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白重组表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；5)通过竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味的结合反应谱，解离常数K

【技术实现步骤摘要】
一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的嗅觉活性剂筛选方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法。
技术介绍
中华蜜蜂(Apisceranacerana，简称中蜂)，是中国土生土长的优良蜂种，也是中国几千年以来养蜂业者的当家蜂种，由于长期的适应进化，中蜂对于中国本土特别是山区的植物生态系统如十字花科、蔷薇科、漆树科和山茶科等植物花香产生良好的嗅觉敏感和适应性。近年来，随着设施农业的开展，特别在冬季草莓设施农业生产过程中，利用中蜂授粉已经成为保障草莓高产高质不可或缺的生产工艺。然而目前在利用中蜂授粉过程中，授粉效率有时较低，这尤其不利于保证冬季设施农业下的蜜蜂授粉效率，从而对冬季草莓的产量和品质产生较大的影响。中蜂授粉效率较低的重要原因是由于中蜂对待授粉植株花朵的气味不敏感，因此迫切需要了解中蜂对哪些气味能产生较强的敏感作用，即快速筛选并鉴定中蜂敏感或有引诱作用的植物花香物质，即嗅觉活性剂。该难题的解决将有助于增加中蜂在设施环境中的嗅觉活力并提高其设施授粉效率。不过由于各种植物花香的挥发物成分种类繁多复杂，如何快速地筛选出合适的嗅觉活性剂配方成为制约中华蜜蜂嗅觉活性剂开发和设计的瓶颈。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法的技术方案。所述的一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1)提取中华蜜蜂工蜂采集蜂触角总RNA；2)设计中华蜜蜂气味结合蛋白基因引物，通过RT-PCR获得中华蜜蜂气味结合蛋白基因全长；3)构建中华蜜蜂气味结合蛋白基因的原核表达载体；4)通过IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白重组表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；5)通过竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味的结合反应谱，解离常数KD低于20μmol/L以下时，确定为适合中华蜜蜂的植物花香气味嗅觉活性剂。进一步的，所述的步骤4)中IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为0.5mmol/L，温度为30℃，诱导转速为200rpm，诱导时间为5h。进一步的，所述的步骤5)中竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味挥发物的结合反应谱的工艺步骤包括：1)荧光配基1-NPN与中华蜜蜂重组气味结合蛋白的结合在281nm激发波长下，向1μmol/L的中华蜜蜂重组气味结合蛋白中逐次加入1mmol/L的1-NPN，充分混匀；2)配基结合和EAG验证选取中华蜜蜂植物花香气味物质和1-NPN进行竞争结合中华蜜蜂重组气味结合蛋白，如果中华蜜蜂植物花香气味物质将1-NPN与AcerOBP2相对荧光值竞争至50％以下，并且解离常数KD低于20μmol/L以下时，则确定为适合中华蜜蜂的嗅觉引诱活性剂。本专利技术从中华蜜蜂嗅觉生理的模式出发，通过分子生物学技术克隆了其气味结合蛋白基因全长，并通过载体构建和原核表达技术获得了编码该基因的重组蛋白，最后通过生物化学配基结合技术探讨了其与植物花香气味物质的亲和力。本专利技术为基于中华蜜蜂花香气味物质的嗅觉活性剂配方的筛选和设计提供了新的策略。附图说明图1为AcerOBP2基因的PCR扩增图；图2为重组阳性质粒的双酶切鉴定图；图3为重组中华蜜蜂化学感受蛋白AcerOBP2诱导表达时间的优化；图4为重组中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP2的分离纯化图5为重组AcerOBP2蛋白与荧光配基1-NPN的荧光结合曲线图；图6为候选配基与荧光配基1-NPN和重组AcerOBP2蛋白的竞争结合图；图7为中华蜜蜂授粉蜂触角对不同花香气味物质的EAG反应对荧光结合验证图。图3中：M：蛋白分子量标准；0：未诱导的pET30/AcerOBP2的BL21(DE3)菌体；1～6：1～6h优化表达产物图4中：M：蛋白分子量标准；1～5：分离纯化的AcerOBP2重组蛋白具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实施例1：收集中华蜜蜂触角总RNA以及气味结合蛋白OBP的基因克隆1中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP2的克隆1.1中华蜜蜂总RNA的提取采用Trizol试剂提取中华蜜蜂工蜂触角的总RNA，具体操作步骤如下：1)从-80℃取出保存的中华蜜蜂工蜂触角样品，放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮快速进行研磨，此步骤在冰上操作，待研成粉末后，称取100mg组织样品装入1.5mL离心管中，然后加入1mlTrizol试剂，漩涡混合器上进行混合；2)将样品在室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；3)4℃，12000×g，离心5min；4)将上清转移至新的离心管中(切勿吸取沉淀)，然后加入200μL的氯仿上下颠倒混匀15s，室温放置15min；5)4℃，12000×g，离心10min；6)转移500μL左右的上清至另一新的离心管中，然后加入200μL的异丙醇，上下颠倒充分混匀后，在15℃静置10min；7)4℃，12000×g，离心10min；8)倒掉上清，然后向离心管中加入1ml浓度为75％的乙醇(1％DEPC水配制)，进行洗涤，4℃，12000×g，离心5min；9)重复步骤8)；10)倒掉上清，先在空气中干燥沉淀5～10min，再用RNasefree水溶解沉淀；11)待RNA完全溶解后，利用NanoDrop超微量紫外分光光度计测定总RNA浓度，再将提取的总RNA保存于-80℃冰箱中，用于反转录合成第一链。1.2第一链cDNA的合成采用TaKaRa公司的反转录试剂盒合成中华蜜蜂的第一链cDNA。实验方法按照试剂盒说明书进行，具体实验步骤如下：总RNA1μLOligo(dt)1μL5×PSBuffer4μLPSRTEnzymeMixⅠ1μLRandom6mers2μLRNase-FreedH2OUpto20μL混匀，进行短暂离心，RT反应程序：37℃15min，85℃5s。试验到此阶段合成了第一链cDNA，将其在-20℃条件下保存备用。1.3基因克隆根据GenBank中登录的意大利蜜蜂ASP2全长(GenBank登录号:AF393493)，设计特异性引物：正向引物：5’-AAGGATCCATGAACACCCTCGTC-3’；反向引物：5’-CGCAAGCTTTTACGAGAACAGTT-3’。为了后续实验操作的需要，即将目的基因片段亚克隆至其他载体上，在设计引物时分别在正、反向引物中加入了BamHI，HindIII酶切位点(用下划线表示)。引物由上海生工公司合成。以中华蜜蜂cDNA为模板，借助ExTaq酶进行PCR扩增AcerOBP2基因。PCR反应体系如下(20μL)：PCR的反应条件为：95℃3min预变性，每个循环94℃45s，50℃45s，72℃45s，进行35个循环，然后72℃延伸10min，16℃forever。PCR结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对目的条带进行检测分析。1.4PCR产物的割胶回收利用AxygenDNA凝胶回收试剂盒对割胶产物进行回收。具体方法如下：1)在紫外灯下切取目的片段，放入1.5mL的离心管中，先称重量，然后按质量比例换算后，加入600μLB本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1)提取中华蜜蜂工蜂采集蜂触角总RNA；2)设计中华蜜蜂气味结合蛋白基因引物，通过RT‑PCR获得中华蜜蜂气味结合蛋白基因全长；3)构建中华蜜蜂气味结合蛋白基因的原核表达载体；4)通过IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白重组表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；5)通过竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味的结合反应谱，解离常数K

【技术特征摘要】
1.基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1)提取中华蜜蜂工蜂采集蜂触角总RNA；2)设计中华蜜蜂气味结合蛋白基因引物，通过RT-PCR获得中华蜜蜂气味结合蛋白基因全长；3)构建中华蜜蜂气味结合蛋白基因的原核表达载体；4)通过IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白重组表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；5)通过竞争性荧光结合方法获得中华蜜蜂重组气味结合蛋白与植物花香气味的结合反应谱，解离常数KD低于20μmol/L以下时，确定为适合中华蜜蜂的植物花香气味嗅觉活性剂。2.如权利要求1所述的一种基于中华蜜蜂气味结合蛋白的植物花香气味嗅觉活性剂配方筛选方法，其特征在于所述的步骤4)中IPTG诱导中华蜜蜂重组气味结合蛋白表达的诱导条件为：IPTG浓度为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红亮，张林雅，吴帆，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33