猪肌抑素基因编辑位点864-883及其应用制造技术

本发明专利技术公开了猪基因组中猪肌抑素基因编辑位点864‑883及其应用，属生物工程领域。本发明专利技术从猪肌抑素基因编码区中分离出1个基因编辑靶位点，其序列为5’‑GGATTTTGAAGCTTTTGGATGGG‑3’，位于MSTN编码区3号外显子。该位点能被Cas9核酸内切酶特异性识别，从而介导双链断裂，然后和打靶载体发生同源重组，将突变基因或选择性标记基因等整合至受体细胞基因组的预定位点。统计结果表明，该位点打靶效率为86.7%。本发明专利技术提供的猪肌抑素基因编辑位点，为对该基因进行精确编辑提供了有效的靶标，为研制高瘦肉率的生猪新品种提供了新策略，也为探明肌抑素的分子机制和信号通路提供了可靠的手段和素材。

【技术实现步骤摘要】
猪肌抑素基因编辑位点864-883及其应用
本专利技术属于生物技术和生物工程领域，具体涉及猪肌抑素基因编辑位点及其应用。
技术介绍
基因转移技术根据外源基因整合的位点特异性可分为两大类，一类是非定点的，即导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，包括显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、逆转录病毒载体感染等：另一类则是定点的，即外源基因导入靶细胞后整合到预先确定的位点或对细胞内靶位点进行定点修饰，这就是依赖于同源重组的基因打靶技术。将外源基因精准敲入猪体细胞的基因组中，一直都是极为困难的，因为早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到很大的限制。直到近年来人工核酸内切酶(engineeredendonuclease,EEN)的出现，才彻底改变了这一现状。锌指核酸内切酶(zincfingerendonuclease,ZFN)是第一代人工核酸内切酶。锌指是一类能够结合DNA的蛋白质，很多转录因子中都含有锌指结构。ZFN是将锌指蛋白的DNA结构域和FokI核酸内切酶中的非特异性的DNA切割结构域组合形成的一种嵌合体蛋白，其既具有锌指蛋白结合DNA的能力又具有核酸内切酶FokI切割DNA双链的能力(KimYG,ChaJ,ChandrasegaranS.Hybridrestrictionenzymes:zincfingerfusionstoFokIcleavagedomain.ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(3):1156-1160.)。利用ZFN可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。到目前为止，ZFN已经成功应用于猪、牛、大鼠、小鼠、斑马鱼、家蚕、果蝇、海胆、拟南芥、烟草、玉米等生物(UrnovFD,RebarEJ,HolmesMC,etal.Genomeeditingwithengineeredzincfingernucleases.NatRevGenet,2010,11(9):636-646.)。但是，由于ZFN制备流程复杂，成本昂贵，而且其技术专利被少数几家商业公司所控制，所以推广应用十分有限。2009年，科学家将一种水稻的致病菌(Xanthamonas)编码的类转录激活因子效应物(transcriptionactivator-likeeffector,TALE)与DNA的碱基对应关系解密(MoscouMJ,BogdanoveAJ.AsimpleciphergovernsDNArecognitionbyTALeffectors.Science,2009,326(5959):1501；BochJ,ScholzeH,SchornackS,etal.BreakingthecodeofDNAbindingspecificityofTAL-typeIIIeffectors.Science,2009，326(5959):1509-1512.)。第二代人工核酸酶——类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)应运而生。和ZFN相似，TALEN主要由TALE蛋白的DNA结合结构域和FokI核酸内切酶结构域组合而成，TALE蛋白含有多个33-35个氨基酸组成的重复肽段，而每一个肽段都能够识别一个碱基。2010年，首次报道TALEN蛋白在酵母中应用成功(LiT,HuangS,ZhaoX,etal.ModularlyassembleddesignerTALeffectornucleasesfortargetedgeneknockoutandgenereplacementineukaryotes.NucleicacidsRes,2011,39(14):6315-6325.)。之后，TALEN在植物、小鼠、斑马鱼、猪、牛等动植物中得到了迅速的推广与应用(JoungJK,SanderJD.TALENs:awidelyapplicabletechnologyfortargetedgenomeediting.NatRevMolCellBiol,2013,14(1):49-55.)。TALEN不仅可以像ZFN一样对复杂的基因组进行精细的修饰，而且其构建更加简单，特异性也更高，因此TALEN出现不久就在很大程度上替代了ZFN。2012年，TALEN被《科学》(Science)杂志评为十大科学突破之一(Breakthroughoftheyear.Therunners-up.Science,2012,338(6114):1525-1532.)。无论是ZFN还是TALEN,这两种人工核酸酶都是嵌合体，都是由经过人工设计的、序列特异性的DNA结合元件和非特异性的DNA切割结构域结合而成的。TALEN与ZFN的作用机制都是先对DNA双链分子靶序列进行切割，形成DNA双链断裂(double-strandbreak,DSB)，然后DSB激活细胞自身的DNA损伤修复机制，从而对该DNA进行定点改造。2013年初，一种继ZFN和TALEN之后的第三代基因定点编辑技术clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)闪亮登场。CRISPR/Cas系统主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，细菌利用此系统可以特异性识别入侵的外源DNA并利用Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解，从而抵抗病毒感染。CRISPR/Cas9基因编辑系统的工作原理：crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基互补配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA，产生DNA双链断裂(DSB)，然后DSB激活细胞内的DNA损伤修复机制，通过两种方式对DNA进行修复，即非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHEJ)或者同源重组修复(homology-directedrepair,HDR)，从而达到定点改造基因组(包括内源基因的敲除或外源基因的定点敲入)的目的。NHEJ是一种非保真的、容易出现遗传突变的修复机制，往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因Knockdown或Knockout。而HDR则是一种高保真的修复机制，不容易出现突变，往往通过供体DNA与基因组DNA之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因Knockin。CRISPR/Cas9技术拥有ZFN和TALEN所不具备的独特优势：1.CRISPR/Cas9系统只需合成一个sgRNA(编码sgRNA的序列不超过100bp)即可实现对基因的特异性修饰，所以操作起来更加简单快捷。2.CRISPR/Cas9系统中，sgRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才能对DNA进行剪切，因此其靶向精确性性更高。3.CRISPR/Cas9系统基因修饰率更高，对基因调控方式更多样(敲除、插入、抑制、激活等)。4.CRISPR/Cas9系统的实验周期更短，可节省大量时间和成本。6.CRIS本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪肌抑素基因MSTN编辑位点864‑883，是一段包含23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’‑GGATTTTGAAGCTTTTGGATGGG‑3’；该位点在猪基因组的准确定位是15号染色体MSTN编码区3号外显子，染色体坐标为105739092‑105739114，编码区坐标为864‑883。

【技术特征摘要】
1.猪肌抑素基因MSTN编辑位点864-883，是一段包含23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’-GGATTTTGAAGCTTTTGGATGGG-3’；该位点在猪基因组的准确定位是15号染色体MSTN编码区3号外显子，染色体坐标为105739092-105739114，编码区坐标为864-883。2.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕延震，刘西梅，郑新民，李奎，任红艳，唐中林，张立苹，陈建武，华文君，华再东，李莉，肖红卫，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42