本发明专利技术涉及一种融合基因，其包含ＧｎＲＨ基因序列和ｐ５３基因序列，以及任选的介于ＧｎＲＨ基因序列与ｐ５３基因序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域（ＯＤＤ）的基因序列。本发明专利技术还涉及一种重组融合蛋白，和所述融合基因的表达型重组体、由其获得的工程菌，以及所述表达型重组体和融合蛋白的制药用途。根据本发明专利技术可以有效地提高ｐ５３的抗肿瘤作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及GnRH-p53系列融合蛋白及其抗肺瘤用途，具体涉及包含p53基因的重组融合蛋白和重组体及其用途，更具体地说，本专利技术涉及利用基因工程技术表达人类肿瘤抑制基因p53与促性腺激素释备抗肿瘤药物中的用途。
技术介绍
目前癌症仍然是严重威胁人类健康的疾病，其发病率和死亡率都很高，特别是腺癌更是临床上最难治疗的恶性肿瘤之一。尽管恶性肿瘤的早期诊断、手术与放化疗等方面的技术和手段近年来都有了长足的进步和发展，但是手术疗法仅限于早期治疗，而化疗和放疗严重的毒副作用往往使得肿瘤患者不能耐受从而限制了其使用剂量和长期应用，进而大大影响了治疗的效果。因此，研究高效低毒治疗肿瘤的方法，制备真正有效的抗肿瘤药物一直以来都是肿瘤治疗研究的目标。靶向性药物的研究是近年来研究的重点。这类靶向性药物可以消除放疗和化疗在杀伤胂瘤细胞的同时也大量杀伤正常细胞的缺点，特异性地针对肿瘤细胞进行杀伤。这类药物主要应用靶向分子(包括肿瘤细胞表面过量表达的受体的配体或单克隆抗体等)可以进入体内特异性地到达肿瘤部位，而与该靶向分子连接的效应蛋白或与其偶联的化疗药物可以在肺瘤部位杀伤肺瘤细胞，从而达到特异性治疗肺瘤的目的。促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone, GnRH)，也称促黄体激素生成激素(LHRH)，是下丘脑分泌的十肽激素，其生理功能是调节垂体前叶促性腺激素的分泌。GnRH必须与高亲和力的跨膜受体结合才能发挥作用。这些跨膜受体属于七次跨膜受体G蛋白偶联受体家族。研究发现，除垂体外，在脑、卵巢、子宫内膜、乳腺、睾丸、前列腺、肾上腺、胰腺和肝脏、肺等肿瘤细胞上均有GnRH受体分布，特别是GnRHm受体特异性分布于肿瘤细胞。试验证实，当GnRH及其类似物与肺瘤细胞上的GnRH受体结合后可以对肿瘤细胞的增殖发挥一定抑制作用。因此，应用GnRH为配体的靶向融合蛋白特异性杀伤肿瘤细胞，是抗癌靶向治疗的一大创新。p53是细胞内重要的肿瘤抑制因子，它可以通过诱导胂瘤细胞凋亡和诱发肿瘤细胞发生细胞周期阻滞而产生抗肿瘤作用。p53基因激活时产生的蛋白质分子量为53000。研究表明人类50。/。以上的肿瘤的发生都与细胞内p53基因突变、缺失有关，因此p53—直是近年来抗肿瘤研究的热点。p53参与凋亡、细胞周期抑制、DNA损伤与修复及衰老等过程。p53蛋白通过诱导编码三个跨膜蛋白Fas、 DR5和PERP，形成死亡诱导信号复合物激活caspases，导致凋亡发生，形成外部凋亡信号途径。p53基因突变的研究为p53基因治疗提供了基础，以p53功能为基础的肿瘤药物研究成为多年来的研究热点。例如应用腺病毒载体进行p53基因治疗，在动物实验和临床研究中都取得了肯定性的抗肿瘤药效。但是使用载体的安全性、基因表达水平的调控及其对病人毒性作用等问题还没有完全解决。p53蛋白可进行原核表达制备，外源性补充野生型p53蛋白或其活性调节分子，可直接发挥它们的肿瘤抑制作用。此法避免了基因治疗的栽体安全性问题，剂量可调，也同样能达到体内表达p53基因的抗肿瘤，增加放、化疗效果的目的。然而，p53发挥作用的部位在细胞内，如何将p53转导进入肿瘤细胞，以及如何避免其对正常细胞的毒性，相对延长它们在肿瘤细胞内的半衰期成为p53靶向性发挥其抗肿瘤作用的关键。已有许多临床证据表明，在缺氧环境下肿瘤细胞发生一 系列适应性变化，使肿瘤细胞对放疗、化疗耐受，而且使肿瘤细胞更具有侵袭性，容易发生远处转移。缺氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是细胞适应缺氧的重要转录因子，参与缺氧时相应靶基因的调控。HIF-l属于bHLHPAS蛋白族，由HIF-la和HIF-ip各两个亚单位组成的杂四聚体蛋白。HIF-la对氧的依赖性较强，当周围环境的氧浓度下降时，HIF-la表达增加。常氧时HIF-la蛋白容易降解，其半衰期小于5分钟，而缺氧可以增加HIF-la蛋白的稳定性，HIF-la蛋白的降解阻止。在研究HIF-1的降解调控时发现，HIF-la的氧依赖性蛋白降解结构域(oxygen國dependent degradation domain, ODD)是HIF-la稳定的重要元件，非缺氧状态时，HIF-1多聚羟化酶(HIF-1prolyhydroxylase, HIF PH)羟化ODD核心脯氨酸(Pro 564)，使得pVHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product)与HIF-la亚基结合，进而多聚蛋白化HIF-la，最终使其被蛋白酶降解，而在缺氧条件下，由于缺少氧原子(必需来自氧分子)使HIFPH失活，以上的反应过程被阻断。HIF-la的ODD含有203个氨基酸残基，Harada等发现ODD的aa548-603可以发挥对其融合蛋白的降解调控作用。如何有效地使p53靶向转导进入肿瘤细胞内，提高融合蛋白在肿瘤细胞内的稳定性以及相对延长融合蛋白在中瘤细胞内的作用时间，减小p53对正常细胞的杀伤作用，仍是本领域技术人员急待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一组包含p53基因的融合基因。本专利技术的另一目的是提供一组由所述融合基因表达的融合蛋白。本专利技术的其它目的包括提供包含所述融合基因的重组体和由本专利技术方法得到的融合蛋白以及所述重组体或融合蛋白在制药中的用途。本专利技术人在研究中令人意外地发现，将GnRH与p53的基因融合以及由此表达所获得的融合蛋白，可以有效地提高p53的抗肿瘤作用；本专利技术人还发现，在上述融合基因中引入缺氧诱导因子基因序列以及由此表达所获得的融合蛋白，可以有效地抑制癌细胞的生长，为肿瘤的临床治疗提供了一种全新的有益方案。基于该发现，本专利技术人完成了本专利技术。因此，本专利技术提供的各个方面和特征概述如下本专利技术第一方面提供一种融合基因，其包含促性腺激素释放激素(GnRH)基因序列和p53基因序列，以及任选的介于GnRH基因序列与p53基因序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的基因序列。根据本专利技术第一方面的融合基因，其具有选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、和SEQ ID NO: 7中所示的DNA序列。具体地说，本专利技术第一方面提供的是编码重组融合蛋白GnRH-p53 、 GnRH-ODD國p53 、 GnRHlE-p53、或GnRHlII-ODD國p53的融合基因，并且所述各融合基因分别具有SEQIDNO: 1、 SEQ IDNO: 3、 SEQ ID NO: 5、和SEQ ID NO: 7中所示的DNA序列。本专利技术第二方面提供一种重组融合蛋白，其包含促性腺激素释放激素(GnRH)氨基酸序列和p53氨基酸序列，以及任选的介于GnRHM酸序列与p53氨基酸序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的氨基酸序列。根据本专利技术第二方面的重组融合蛋白，其选自重组融合蛋白GnRH誦p53 、 GnRH國ODD画p53 、 GnRHffl-p53和GnRHlII-ODD-p53 ，并且所述重组融合蛋白分别具有SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQID NO: 6、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合基因，其包含ＧｎＲＨ基因序列和ｐ５３基因序列，以及任选的介于ＧｎＲＨ基因序列与ｐ５３基因序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域（ＯＤＤ）的基因序列。
【技术特征摘要】
1、一种融合基因，其包含GnRH基因序列和p53基因序列，以及任选的介于GnRH基因序列与p53基因序列之间的缺氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的基因序列。2、 根据权利要求l所述的融合基因，其具有选自SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 5、和SEQ ID NO: 7中所示的DNA 序列。3、 一种重组融合蛋白，其包含GnRH M^列和p53 M酸 序列，以及任选的介于GnRH氨基酸序列与p53氨基酸序列之间的缺 氧诱导因子的氧依赖性蛋白降解结构域(ODD)的氨基^列。4、 根据权利要求3所述的重组融合蛋白，其选自重组融合蛋白 GnRH隱p53 、 GnRH國ODD画p53 、 GnRHm陽p53和GnRHm-ODD國p53, 并且所述重组融合蛋白分别具有SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6、和SEQ ID NO: 8中所示的^J^酸序列。5、 一种包含如权利要求1或2所述融合基因的表达型重组体，其 表达载体选自原核表达载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾培媛，王玉霞，赵宇，武军华，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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