Exendin‑4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及一种Exendin‑4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白和制备方法及用途，该融合蛋白由2分子Lixisenatide串联，其C端与人血清白蛋白N‑端连接，或者2分子Lixisenatide串联后，通过连接肽与人血清白蛋白连接，其结构式为(Lixisenatide)2‑HSA或者(Lixisenatide)2‑linker‑HSA。该融合蛋白属长效药物‑重组融合蛋白可有效降低动物体内血糖浓度，并延长Lixisenatide的半衰期。该融合蛋白在治疗II型糖尿病、肥胖症、脂肪肝及多囊卵巢综合症方面具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术与基因工程制药领域，特别涉及一种Exendin-4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白及制备方法和用途。
技术介绍
促胰岛素分泌肽(Exendin-4)是一条39个氨基酸组成的直链多肽，发现于南美巨蜥的唾液中，其氨基酸序列与人类血液中调控血糖的胰高血糖素类似肽GLP-1有53％的同源性。Exendin-4是一种GLP-1受体激动剂，能模拟GLP-1这种内源性多肽的糖调控作用，降低空腹和餐后血糖。Exendin-4的活性主要通过与人体胰脏GLP-1受体结合而介导，由环腺苷酸(cAMP)依赖和β细胞分化机制引发葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌。Exendin-4不被二肽基肽酶－IV(DPP-IV)降解，在治疗II型糖尿病方面引起广泛关注，但Exendin-4药物有半衰期短的问题。Lixisenatide是Exendin-4的突变体，其结构为将Exendin-4去掉38位的Pro，并在39位的Ser接6个Lys。经过了结构修饰，Lixisenatide的半衰期相对Exendin-4有所延长，可每日一次皮下注射，但作为II型糖尿病的治疗药物其半衰期仍然较短。人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是血液中的一个非常重要的天然蛋白，分子量约为66KD，具有多种生物学功能，是许多生物因子的载体蛋白，因其不能被肾小球滤过，在血液中半衰期长达14-21天，通常被用于药物的载体，以延长药物的半衰期。目前，Exendin-4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白还未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种Exendin-4突变体与人血清白蛋白的融合蛋白及制备方法和用途。所述融合蛋白在保持Lixisenatide的生物活性同时，延长其半衰期，使之成为新一代长效治疗糖尿病药物，并能在治疗肥胖症、脂肪肝及多囊卵巢综合症方面起作用。本专利技术的技术方案是：一种Exendin-4突变体(Lixisenatide)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述人血清白蛋白为人血清白蛋白全序列或者人血清白蛋白部分结构域片段。所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的融合蛋白由1分子Lixisenatide的C-端与1分子Lixisenatide的N-端直接串联，2分子Lixisenatide串联后C-端与人血清白蛋白N-端直接连接，其结构通式为(Lixisenatide)2-HAS。所述氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的融合蛋白由1分子Lixisenatide的C-端与1分子Lixisenatide的N-端直接串联，2分子Lixisenatide串联后C-端与人血清白蛋白N-端通过连接肽连接，其结构通式为(Lixisenatide)2-Linker-HSA。所述连接肽为序列(GGGGS)n的肽，其中n为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，优选n为3。含有上述融合蛋白的编码基因的表达载体，优选地，所述表达载体选自pPIC9，或者pPIC9K，或者pPICZαA，或者pPICZαB，或者pPICZαC，或者pPICZA，或者pPICZB，或者pPICZC，或者pPIC3.5K。包含上述表达载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞为细菌或真菌；优选地，所述宿主细胞为酵母；优选地，所述宿主菌为毕赤酵母；优选地，所述毕赤酵母选自KM71，或者GS115，或者X-33，或者SMD1168。上述融合蛋白的制备方法，有以下步骤：1)构建融合蛋白重组表达载体(Lix)2-HSA-pPIC9、(Lix)2-L-HSA-pPIC9，获得重组表达工程菌(Lix)2-HSA-pPIC9/GS115、(Lix)2-L-HSA-pPIC9/GS115；2)转化酵母宿主细胞；3)培养能够表达权利要求1所述的融合蛋白宿主细胞；4)从所述宿主细胞的培养物中回收所述融合蛋白；5)回收的融合蛋白纯化，得到Exendin-4突变体(Lixisenatide)与人血清白蛋白(HSA)的重组融合蛋白。上述融合蛋白在制备治疗糖尿病药物中的用途或制备用于减肥制剂中的用途。上述融合蛋白在制备治疗心血管疾病或脂肪肝或多囊卵巢综合症药物中的用途。本专利技术针对Lixisenatide半衰期短问题，采用基因工程技术制备两分子Lixisenatide与人血清白蛋白的融合蛋白，可增加Lixisenatide的稳定性，延长其在人体内的半衰期，提高对糖尿病的治疗效果；本专利技术所述融合蛋白用于制备治疗糖尿病药物，具有高稳定性、低副作用的良好效果。同时运用融合蛋白技术可以避免复杂的化学修饰和处理过程，易操作，降低成本。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用基因重组技术，将2分子Exendin-4突变体Lixisenatide和人血清白蛋白进行融合表达，在保持Lixisenatide的药理特性的基础上延长其在体内的半衰期。在药学领域包括II型糖尿病、肥胖症、脂肪肝、心血管疾病及多囊卵巢综合症治疗方面具有良好的应用前景。附图说明图1为本专利技术构建的表达质粒结构图；图2为本专利技术构建的毕赤酵母表达工程菌摇瓶诱导筛选结果；图3为本专利技术制备的融合蛋白SDS-PAGE电泳图；图4为N端测序图谱；图5为融合蛋白体外生物活性测定结果，其中，图5-1为转染后的细胞过表达GLP-1R蛋白的测定结果，图5-2为阳性细胞株筛选的测定结果，图5-3为融合蛋白生物活性检测结果；图6为正常小鼠的糖耐量测试结果，其中，图6-1、图6-2、图6-3分别为0.5h、12h、30h小鼠糖耐量反应的实验结果；图7为糖尿病模型鼠测试结果；图8为肥胖鼠模型测试结果，其中，图8-1为1-14天融合蛋白在肥胖模型鼠上减肥结果，图8-2为14天后融合蛋白在肥胖模型鼠上减肥结果。具体实施方式实施例1 重组促胰岛素分泌肽突变体(Lixisenatide)融合蛋白工程菌构建1、工程菌构建Exendin-4突变体Lixisenatide(Lix)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人血清白蛋白(HSA)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将2分子Lixisenatide和人血清白蛋白直接连接，融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，相应的编码核酸序列如SEQ ID NO.5所示。将2分子Lixisenatide和人血清白蛋白用连接肽(L)连接，融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，相应的编码核酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述融合蛋白对应的编码核酸序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6，分别在5’端加上pPIC9载体序列CTCGAGAAAAGA(下划线为XhoI识别序列)，分别在3’端加上序列TGATAA(下划线为两个终止密码子序列，方框为NotI识别序列)。将设计的融合蛋白核酸序列委托通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成，并通过XhoI/NotI位点亚克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9，构建获得表达载体(Lix)2-HSA-pPIC9、(Lix)2-L-HSA-pPIC9，构建示意图如图1所示。将构建的两种表达载体用SacI限制性核酸内切酶进行酶切，分别制备10μg线性化载体。用电击方法转化GS115感受本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Exendin‑4突变体(Lixisenatide)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种Exendin-4突变体(Lixisenatide)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述人血清白蛋白为人血清白蛋白全序列或者人血清白蛋白部分结构域片段。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的融合蛋白由1分子Lixisenatide的C-端与1分子Lixisenatide的N-端直接串联，2分子Lixisenatide串联后C-端与人血清白蛋白N-端直接连接。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的融合蛋白由1分子Lixisenatide的C-端与1分子Lixisenatide的N-端直接串联，2分子Lixisenatide串联后C-端与人血清白蛋白N-端通过连接肽连接。5.根据权利要求4所述的的融合蛋白，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李树刚，张伟，辛渝，柴新娟，程丹凝，杨丹丹，余英鹏，曹莉君，于廷和，
申请(专利权)人：重庆科润生物医药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50