一种高纯度重组人血小板源性生长因子BB的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种高纯度重组人血小板源性生长因子BB的制备方法，该制备方法包括优化人血小板源性生长因子B链的编码基因，通过接头在其编码的人血小板源性生长因子B链N端融合一个在毕赤酵母中易于高效表达的融合标签。本发明专利技术还提供了包含编码上述融合蛋白的核酸的表达载体、包含所述表达载体的工程菌，以及利用该工程菌制备重组人血小板源性生长因子BB的方法。本发明专利技术所述方法制备的重组人血小板源性生长因子BB具有与天然蛋白相同的生物活性，且具有N端均一，高纯度等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域中一种包含重组人血小板源性生长因子B链的融合蛋 白及其编码基因与重组人血小板源性生长因子BB的制备方法。
技术介绍
人血小板源性生长因子（PDGFs)是贮存于血小板a颗粒中的一种碱性蛋白质。能 刺激停滞于G0/G1期的成纤维细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞等多种细胞进入分裂增殖 周期，它向间质源细胞施以有力的促有丝分裂和趋化活性。TOGFs在胚胎发育、细胞分化和 对组织损伤的反应等过程中具有许多极为重要的作用。它是创面愈合过程中较早出现的生 长因子之一。特别是对一些慢性难愈性伤口，如糖尿病溃疡、慢性静脉性溃疡、压疮、放射性 溃疡等均有明显促进愈合作用。 人血小板源性生长因子在人体内有三种活性形式分别是：TOGF-AA、TOGF-AB、 TOGF-BB，其中TOGF-BB活性最高。TOGF-BB，是一种同源二聚体蛋白质，依靠两条多肽链间 两对二硫键链接，同时，两条多肽链链内各有三对二硫键。 1998与1999年美国药品食品监督管理局（FDA)与欧洲药品评价局（EMEA)先后 批准酵母表达的重组人血小板源性生长因子BB (rhPDGF-BB)用于糖尿病足的治疗，商品名 为贝卡普明。在2005年-2012年间，美国FDA、加拿大、欧盟EMEA、澳大利亚等国先后批准 rhH)GF-BB用于牙龈萎缩及牙骨缺失的治疗（商品名为GEM21S)。GEM21S为rhH)GF-BB与 磷酸三钙的组合医疗器械，用于患处时，rhH)GF-BB可迅速从产品中释放至患处及周围 组织中，发挥其趋化性、促细胞分裂的作用，促进牙周组织、成骨细胞再生，并向患处聚集， 形成新牙周组织和牙骨质附着层。 尽管rhH)GF-BB在临床可用于治疗糖尿病足和牙周疾病，解决患者疾苦，但是当 前上市产品仍存在质量风险。主要表现为rhH)GF-BB在酵母表达过程中，受蛋白酶作用导 致降解。降解位置主要发生在N端第5和6位氨基酸之间，由于仅相差5个氨基酸，利用目 前的纯化方法难以分离，导致成品蛋白质分子中，存在两条肽链N端不均一的产物。在EMEA 对GEM21S的评审报告中，要求研发企业采取有效手段来控制降解产物含量。但是研发企业 尽管采取了工程菌改造、高选择性色谱纯化等手段和措施，在已上市产品中仍然存在N端 不均一产物，并有可能影响产品活性。 本专利技术针对上述技术难题，提供一种新的高纯度rhTOGF-BB的制备方法，解决了 上市的同类产品N端不均一及活性等问题。通过融合表达技术，增加降解产物与未降解产 物的理化性质差异，并进一步通过纯化彻底分离不均一产物，实现产物N端完全均一。通过 选择合适的融合标签，保证其生物活性与天然蛋白一致。且融合标签为在毕赤酵母中高效 表达的蛋白，同时增加目的蛋白的表达量，明显提高得率。为rhH)GF-BB与磷酸三钙组 合，开发三类医疗器械，解决瓶颈技术问题，奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种优化的编码重组人血小板源性生长因子B链的核酸 分子。 本专利技术的另一目的在于提供一种融合标签蛋白，该融合标签分子能促进重组人血 小板源性生长因子BB的表达，且不影响重组人血小板源性生长因子B链自发形成具有生物 活性的高级结构。 本专利技术的另一目的在于提供一种宿主细胞，其能够表达包含上述融合标签和重组 人血小板源性生长因子B链的融合蛋白。 本专利技术的另一目的在于利用上述宿主细胞制备N端完全均一的高纯度的重组人 血小板源性生长因子BB。 本专利技术采用的技术方案是： 一种经优化的编码重组人血小板源性生长因子B链的核酸分子，其具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 -种融合标签蛋白，包括来源于酿酒酵母的葡糖淀粉酶或其片段；优选地，所述融 合标签蛋白为来源于酿酒酵母的葡糖淀粉酶（GenBank :AAA20560. 1)的第367-482位氨基 酸，并且其中，所述葡糖淀粉酶的第415位天冬氨酸被突变为丝氨酸，第435位天冬氨酸被 突变为甘氨酸；更优选地，所述融合标签的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。编码所述融合 标签的核酸分子具有SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列 如SEQ ID N0. 3所示。所述融合标签促进重组人血小板源性生长因子BB高效表达，其不影 响重组人血小板源性生长因子B链自发形成具有生物活性的同源二聚体高级结构。 一种包含重组人血小板源性生长因子B链的融合蛋白，其为通过接头（Linker)将 上述融合标签融合至所述人血小板源性生长因子B链N端，其中所述接头包含酶切位点； 优选地，所述酶切位点位于接头C端；优选地，所述酶切位点为肠激酶酶切位点；优选地，所 述接头还包含柔性连接肽-(GGS) n-、组氨酸标签或其组合；优选地，所述接头的氨基酸序 列为-GGSHHHHHHGGSGGSGSEFDDDDK-，其编码核酸序列为 GGAGGITCCCATCACCATCACCATCACGG AGGTTCTGGAGGTTCTGGTTCCGAATTCGATGACGATGACAAG ;优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID N0. 4所示；优选地，所述融合蛋白以单体或二聚体形式存在。编码所述融合蛋白的 核酸分子，优选地，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示。 -种包含编码上述融合蛋白的核酸分子的载体。优选地，所述载体为表达载体；优 选地，所述表达载体选自PPIC9、pPIC9K、pPICZ a A、pPICZ a B、pPICZ a C、pPICZA、pPICZB、 pPICZC或pPIC3. 5K。 -种包含所述载体的宿主细胞，其能够表达所述融合蛋白。优选地，所述宿主细胞 为细菌或真菌；优选地，所述宿主细胞为酵母；优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母；优选地， 所述毕赤酵母选自GS115、X-33、KM71或SMD1168。。 -种制备所述融合蛋白的方法，其包括，培养所述的宿主细胞，和，从所述宿主细 胞的培养物中回收所述融合蛋白；优选地，所述融合蛋白被分泌到宿主细胞的胞外或者在 宿主细胞的胞内表达。 -种重组人血小板源性生长因子BB的制备方法，其主要步骤包括： 1)培养表达所述融合蛋白的宿主细胞； 2)从所述宿主细胞的培养物中回收所述融合蛋白； 3)对回收的融合蛋白进行酶切，并从酶切产物中回收重组人血小板源性生长因子 BB； 优选地，所述融合蛋白经肠激酶酶切。 本专利技术的有益效果是： 通过接头将融合标签融合至人血小板源性生长因子B链N端形成融合蛋白，进行 融合表达，使得发生降解和未降解产物理化性质差距拉大，从而利用纯化手段将发生降解 和未降解产物完全分离，得到N端完全均一的人血小板源性生长因子BB，解决了目前国内 外存在的技术难题。 通过接头序列-GGSHHHHHHGGSGGSGSEFDDDDK-实现融合表达，其包含柔性连接 肽-(GGS) n-，使得融合标签未对目的蛋白高级结构的形成造成影响，重组人血小板源性生 长因子B链能自发形成具有生物活性的同源二聚体；包含组氨酸标签，利于纯化，提高收 率；包含肠激酶位点-DDDDK-，使得融合标签被有效去除，最终获得的重组人血小本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合标签蛋白，该蛋白为来源于酿酒酵母的葡糖淀粉酶的第367‑482位氨基酸，并且其中，所述葡糖淀粉酶的第415位天冬氨酸被突变为丝氨酸，第435位天冬氨酸被突变为甘氨酸；所述融合标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李树刚，张伟，但国平，于廷和，柴新娟，辛渝，王勇，
申请(专利权)人：重庆科润生物医药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85