本发明专利技术涉及血小板衍生生长因子B衍生物，具体地，本发明专利技术涉及血小板衍生生长因子B突变体，编码该突变体的核酸分子，含有该核酸分子的载体和宿主细胞。本发明专利技术还涉及所述突变体的制备方法和纯化方法，以及所述突变体用于制备促进细胞分裂、增殖、促进伤口愈合、皮肤再生、骨骼与牙齿缺损再生、关节修复的药物中的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及血小板衍生生长因子B衍生物，具体地，本专利技术涉及血小板衍生生长 因子B突变体，编码该突变体的核酸分子，含有该核酸分子的载体和宿主细胞。本专利技术还涉 及所述突变体的制备方法和纯化方法，以及所述突变体用于制备促进细胞分裂、增殖、促进 伤口愈合、皮肤再生、骨骼与牙齿缺损再生、关节修复的药物中的用途。
技术介绍
血小板衍生生长因子（Platelet-derivedgrowthfactor，F1DGF)是一种能多种细 胞产生的、能够刺激间质来源细胞增殖的多肽，上世纪70年代首先由Ross等从血小板中发 现，因而得名（1)。到目前为止，共发现4种PDGF单体PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D。 这些单体彼此通过链内及链间二硫键，形成5种同源或异源二聚体：H)GF-AA、TOGF-BB、 H)GF-AB、roGF-CC和H)GF-DD(2, 3)。普遍认为I3DGF基因和蛋白属于一类在结构与功能上相 关的生长因子家族，这个家族还包括血管内皮生长因子（VEGFs)以及胎盘生长因子（PIGF) (4)。I3DGF通过激活其受体I3DGF-R发挥生理功能。I3DGF-R包括I3DGFR-a和TOGFR-P两 种，属于酪氨酸激酶受体。配体与受体结合引发受体单体的二聚化，促使胞内区的酪氨酸 残基自体磷酸化而激活。两种受体可以激活多条信号通路关键分子，如Ras-MAPK、PI3K和 PLC-Y(5)，进而激活相关基因的转录，刺激细胞生长、抑制凋亡，促进分化，引起定向移动 和迁移等，发挥多种多样的生物学功能。 roGF-b基因定位于第22号染色体，含有7个外显子基因，编码241个氨基酸组 成的前体蛋白，经蛋白酶水解加工形成的最终成熟产物是109个氨基酸组成的，分子量为 12. 3kD的多肽。在生物体内，TOGF-B蛋白的活性形式是由两条单体通过二硫键形成同源 TOGF-BB或异源二聚体TOGF-AB(6)。每条TOGF-B蛋白单体含有8个高度保守的半胱氨酸 残基，其中6个半胱氨酸两两形成链内二硫键（CysI-VI，III-VLV-VDI)，另外两个则与 对应单体之间交叉形成链间二硫键（CysII-IV)(7)共同形成TOGF蛋白家族特征性的生 长因子结构域一半胱氨酸结。这些链内及链间二硫键构成了TOGF-BB二聚体蛋白复杂的空 间结构（图1B)。 另外，PDGF蛋白在表达合成时还存在不同剪切形式，使得加工成熟后的TOGF蛋白 呈现多种结构形式。从人血小板提取物中分离纯化的H)GF-BB，通过N端氨基酸序列分析表 明存在至少三种不同的剪切形式，20%Serl，45%Thr6及35%Thr33,这些切割的异质性， 致使在纯化I3DGF-BB时各种切割形式的蛋白比例不可控（8)。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人经过大量研究，发现特定位点蛋白酶降解和/或糖基化修饰是造 成多种TOGF-B存在的主要原因，进而通过位点突变获得了TOGF-B突变体，其蛋白均一性大 大提高，并且仍保留TOGF-B蛋白的活性。 本专利技术第一方面涉及血小板衍生生长因子B突变体，其在野生型血小板衍生生长 因子B的第101位和第109位氨基酸位点处具有突变（此处对氨基酸位点位置的描述均以 含109个氨基酸残基的成熟TOGF-B为基础，以下同），并且具有血小板衍生生长因子B的活 性。 根据本专利技术第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其在第6位氨基酸 位点处具有突变，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。 根据本专利技术第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其在第32位和/或 第33位氨基酸位点处具有突变，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。 根据本专利技术第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，与野生型血小板衍 生生长因子B相比，其N端缺失5个氨基酸，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。 在本专利技术的一个实施方案中，所述突变体在第6位、第101位和第109位氨基酸位 点处突变为丙氨酸。 在本专利技术的另一个实施方案中，所述突变体在第101位和第109位氨基酸位点处 突变为丙氨酸。 根据本专利技术第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其在第32位和/或 第33位氨基酸位点处突变为脯氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。 在本专利技术的一个实施方案中，其在第32位氨基酸位点处突变为脯氨酸、缬氨酸或 异亮氨酸，优选为脯氨酸。 根据本专利技术第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其中所述的血小 板衍生生长因子B为哺乳动物来衍生的血小板衍生生长因子B，所述哺乳动物例如为人、小 鼠。 在本专利技术的一个实施方案中，所述血小板衍生生长因子B突变体为，其N端缺失5 个氨基酸，其第6位、第101位和第109位氨基酸突变为丙氨酸，其第32位氨基酸突变为脯 氨酸。 在本专利技术的一个实施方案中，所述血小板衍生生长因子B突变体为，其N端缺失5 个氨基酸，其第101位和第109位氨基酸突变为丙氨酸，其第32位氨基酸突变为脯氨酸。 在本专利技术的一个实施方案中，所述血小板衍生生长因子B突变体为，其N端缺失5 个氨基酸，其第6位、第101位和第109位氨基酸突变为丙氨酸，其第32位氨基酸突变为缬 氨酸。 在本专利技术的一个实施方案中，所述血小板衍生生长因子B突变体为，其N端缺失5 个氨基酸，其第6位、第101位和第109位氨基酸突变为丙氨酸，其第32位氨基酸突变为异 亮氨酸。 本专利技术还包括上述各种技术方案的组合。 在本专利技术的具体实施方案中，所述突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:3或SEQID NO:5所示的序列。 根据本专利技术第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其氨基酸序列经过 取代、缺失或添加一个几个氨基酸，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。 本专利技术第二方面涉及血小板衍生生长因子同源或异源二聚体，其由两个本专利技术第 一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体通过链内及链间二硫键结合而成，或者由一 个本专利技术第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体与一个血小板衍生生长因子A通 过链内或链间二硫键结合而成。 在本专利技术中，所述血小板衍生生长因子同源或异源二聚体的形成方式与野生型血 小板衍生生长因子相同。 在本专利技术的实施方案中，两个本专利技术第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突 变体通过链内及链间二硫键结合，形成I3DGF-BB突变体。 本专利技术第三方面涉及核酸分子，其编码本专利技术第一方面任一项的血小板衍生生长 因子B突变体。 根据本专利技术第三方面任一项的核酸分子，其核苷酸序列选自SEQIDNO:4、SEQID NO:6~SEQIDNO:9 的序列。 本专利技术第四方面涉及载体，其含有本专利技术第三方面任一项的核酸分子。 在本专利技术中，本领域技术人员可以根据用于表达的宿主细胞的不同来选择表达载 体，例如可以选择适合酵母细胞或哺乳动物细胞表达的载体。 在本专利技术的实施方案中，所述载体为pMEX9K。 本专利技术第五方面涉及宿主细胞，其含有本专利技术第四方面任一项的载体。 根据本专利技术第五方面任一项的宿主细胞，其为真核细胞，例如为酵母细胞、哺乳动 物细胞或昆虫细胞。 根据本专利技术第五方面任一项的宿主细胞，所述酵母细胞例如为毕赤酵母细胞 (Pichiapastoris，也叫巴斯德毕赤酵母细胞）、酿酒酵母（Sacch本文档来自技高网...
【技术保护点】
血小板衍生生长因子B突变体，其在野生型血小板衍生生长因子B的第101位和第109位氨基酸位点处具有突变，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，张晓鹏，于长明，付玲，戴萌萌，张军，徐俊杰，侯利华，李建民，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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