一种高活性的重组猪表皮生长因子的制备方法技术

技术编号:14470409 阅读:216 留言:0更新日期:2017-01-21 02:30
本发明专利技术公开了一种高活性的重组猪表皮生长因子的制备方法。本发明专利技术首先公开了SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列及包含它的重组载体、重组菌。本发明专利技术方法可以高效表达重组猪表皮生长因子的率高,且制备得到的重组猪表皮生长因子的活性高,具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域,具体涉及一种高活性的重组猪生长因子制备方法。
技术介绍
表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)是一种多功能的生长因子,在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。表皮生长因子通过与细胞表面的受体表皮生长因子受体(EGFR)结合,激发受体内在的酪氨酸激酶的活性,从而启动了信号传导级联而导致多种生物化学变化,细胞内钙水平上升,增加糖酵解与蛋白质合成,增加某些基因(包括表皮生长因子受体)的表达,最终导致DNA合成和细胞增殖。表皮生长因子在乳中含量丰富,其受体在消化道内分布广泛,因此在初生动物的胃肠道发育中具有重要作用。在现代集约化养殖中,应用猪表皮生长因子可以增强幼龄动物的健康水平,增强动物整体生产性能,是从根本上解决猪快速生长和器官发育滞后矛盾的手段之一。因此,人工生产制备住表皮生长因子显得尤为重要。焦晓军,“重组毕赤酵母高密度发酵表达猪表皮生长因子及其纯化鉴定”,华南农业大学学报2011年1月第32卷第1期,以及汪洋等“猪表皮生长因子在毕赤酵母中的表达及鉴定”,中国农业科学2007,40(11):2593-2599均公开了利用毕赤酵母重组表达猪表皮生长因子的方法,但是表达得到的重组猪表皮生长因子的活性不够高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种高活性的重组猪表皮生长因子的制备方法。本专利技术提供了SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术还供了一种重组载体,它包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。优选地,所述重组载体是重组毕赤酵母表达载体pPIC9K。本专利技术还供了一种重组菌,其特征在于:它包括前述的重组载体。优选地,所述重组菌为重组毕赤酵母。本专利技术还供了一种发酵方法,其特征在于:它是将前述的重组菌,置于酵母菌培养基中培养,甲醇诱导表达,即可。优选地,它包括如下步骤:(1)菌体生长:将重组菌接种到BMGY培养基中,于25~35℃培养36~60h,离心收集菌体;(2)诱导表达:再用BMMY诱导培养基悬浮菌体,在25~35℃下诱导培养48~120h.进一步优选地,步骤(1)中,培养温度为30℃,培养时间为48h;步骤(2)中,培养温度为30℃,诱导时间为72h。本专利技术还供了前述方法制备得到的表达产物,比如发酵得到的培养液。本专利技术还供了一种纯化重组猪表皮生长因子的方法,步骤如下:a、取前述表达产物,离心,透析;b、色谱分离,即可。色谱分离的方法是:先采用Ultrasphere-ODS色谱柱分离,再采用C18色谱柱中分离。本专利技术还供了前述方法制备得到的纯化产物。本专利技术还供了前述表达产物、前述纯化产物在制备提高仔猪生长性能的药物或者饲料添加剂中的用途。本专利技术方法重组表达得到重组猪表皮生长因子,其活性非常高,最高比市售hEGF高了3.97倍,而且表达水平也较高,制备得到的包含重组猪表皮生长因子发酵培养液以及分离纯化后的洗脱液,其EGF活性高,含量也较高,安全,营养价值高,可用于制备提高仔猪生长性能的药物或者饲料添加剂。显然,根据本专利技术的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式,对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1转化子的PCR结果图,其中,泳道1,3,5,7,8,9,10,11,13,14,15,16,17,19,21,22属于阳性克隆,泳道2、4、6、12、18、20、23属于阴性克隆,M是marker,CK是对照。图2表达产物表皮生长因子的SDS-PAGE分析;图3ELISA标准曲线;图4EGF洗脱图;图5本专利技术方法与猪表皮生长因子基因直接表达的比较图。M:Marker;泳道1,3,4,7,9,11为EGF基因表达情况,泳道2,4,6,8,10,12为EGF-n基因表达情况;图6分子筛纯化的色谱图,色谱图中加入maker,以标记本专利技术收集产物的分子量;图7EGF对成纤维细胞生长率的影响;图8部分浓度细胞生长情况的显微镜照片。具体实施方式实施例1制备含有目标基因片段的工程菌一、重组猪表皮生长因子基因的获得1、基因序列分析从NCBI数据库中调取已知猪表皮生长因子基因,同时除去表皮生长因子中信号肽部分,获得如下序列:AATAGTTACTCTGAATGCCCGCCGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGGTGGTGTGTGTATGTATATTGAAGCCGTCGACAGCTATGCCTGCAACTGTGTTTTTGGCTACGTTGGCGAGCGATGTCAGCACAGAGACTTGAAATGGTGGGAGCTGCGCTAA序列共计162bp,编码含53个氨基酸残基的蛋白质:nsysecppshdgyclhggvcmyieavdsyacncvfgyvgercqhrdlkwwelr猪表皮生长因子DNA序列合成对猪表皮生长因子基因序列进行分析,设计新EGF基因并进行合成,命名为EGF-n(SEQIDNO.2):AATTCTTACTCTGAATGTCCACCTTCCCACGACGGTTACTGTTTGCACGGTGGTGTTTGTATGTATATTGAAGCTGTTGATTCTTACGCTTGTAACTGTGTTTTTGGTTACGTTGGTGAAAGATGTCAGCATAGAGATTTGAAGTGGTGGGAACTGAGATAA二、重组菌的构建1.pPIC-EGF-n载体的构建全基因EGF-n通过EcoRI/NotI位点克隆到毕赤酵母组成型表达载体pPIC9K上,得到重组载体pPIC-EGF-n,具体操作按照《分子克隆实验手册》重组操作部分进行。2.毕赤酵母的电击转化及筛选将重组载体pPIC-EGF-n用BlnI酶切使之线性化,电击转化毕赤酵母。挑取阳性转化子。电转化及跳去阳性转化子的方法参见Invitrogen公司操作手册。通过PCR的方法使用EGF-n基因的特异引物(5’端基因引物:GAATTCAATTCTTACTCTGAATGTCCA;3’端载体引物3’AOX:GCAAATGGCATTCTGACATCC)对阳性转化子进行PCR检测。如图1的PCR结果所示,阴性转化子中无目标基因片段,阳性转化子中含有目标基因片段EGF-n,说明本专利技术得到了含有目标片段EGF-n的阳性转化子:重组毕赤酵母。实施例2采用本专利技术重组毕赤酵母重组表达猪表皮生长因子1、表达(1)表达方法取实施例1构建的重组毕赤酵母在5mLBMGY培养基中于30℃摇床培养48h,离心收集菌体,加入1mLBMMY甲醇诱导培养基悬浮菌体,继续在30℃下诱导培养96h,期间间隔12h取样检测。BMGY培养基:2%蛋白胨,1%酵母提取物,100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0),1.34%YNB,4×10-5%生物素,1%甘油;BMMY诱导培养基:2%蛋白胨,1%酵母提取物,100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0),1.34%YNB,4×10-5%生物素,0.5%甲醇。(2)检测2.1表达产物表皮生长因子的SDS-PAGE分析取诱导24-96小时后的培养液,离心取本文档来自技高网...

【技术保护点】
SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。2.一种重组载体,其特征在于:它包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列;优选地,所述重组载体是重组毕赤酵母表达载体pPIC9K。3.一种重组菌,其特征在于:它包括权利要求2所述的重组载;优选地,所述重组菌为重组毕赤酵母。4.一种制备重组猪表皮生长因子的方法,其特征在于:它是将权利要求3所述的重组菌,置于酵母菌培养基中培养,甲醇诱导表达,即可。5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:它包括如下步骤:(1)菌体生长:将重组菌接种到BMGY培养基中,于25~35℃培养36~60h,离心收集菌体;(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员:邹辉琴李钢高静雷温静康健王定越
申请(专利权)人:四川华德生物工程有限公司
类型:发明
国别省市:四川;51

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