布鲁氏菌104M疫苗株敲除Per基因的重组菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种布鲁氏菌104M疫苗株敲除Per基因的重组菌及应用。本发明专利技术提供了重组菌，为降低和/或抑制布鲁氏菌104M中Per蛋白活性得到的菌。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术经过敲除布鲁氏菌104M的毒力基因Per得到重组菌，通过对其毒力和免疫原性的研究，筛选出人用布鲁氏菌减毒疫苗候选株△Per。

Recombinant strain of Brucella 104M vaccine strain knocking out Per gene and its application

The invention discloses a recombinant bacterium for killing Per gene of Brucella 104M vaccine strain and its application. The present invention provides recombinant bacteria to reduce and / or inhibit the activity of Per protein in Brucella 104M. The experiment, after the invention on virulence gene Per of Brucella 104M in addition to get recombinant bacteria, through the study on its virulence and immunogenicity, screened with Brucella vaccine candidate strain Per.

【技术实现步骤摘要】
布鲁氏菌104M疫苗株敲除Per基因的重组菌及应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种布鲁氏菌104M疫苗株敲除Per基因的重组菌及应用。
技术介绍
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(BruceLLa)感染引起的一种慢性传染性疾病，也是世界范围内危害公共卫生安全的重大人畜共患传染病。在家畜中，牛、羊、猪最常发生，且可传染给人和其他家畜，其特征是生殖器官和胎膜发炎，引起母畜流产、公畜不育和各种组织的局部病灶，患病的牛、羊、猪、犬等也是人类布鲁氏菌病的主要传染源。人感染布鲁氏菌病可以引起发热、关节痛、疲乏无力，部分患者转为难以治愈的慢性病人。布鲁氏菌病在全世界范围内广泛流行，自2000年以后，我国人畜布鲁氏菌病发病率逐年上升，对畜牧业发展带来巨大危害，同时给我国公共卫生安全带来了巨大威胁，防控形势十分严峻。布鲁氏菌病的疫苗免疫是控制布病的有效方法，但是目前我国使用的人布鲁氏菌疫苗104M的安全性还存在很多问题。全球预防动物布鲁氏菌感染的疫苗主要有S19、Rev1和RB51。人用布鲁氏菌疫苗为BA-19(Br.Abortus缩写)和104M(Mockba的缩写)菌苗。1923年美国人Buck从牛体中分出一株牛种19号弱毒菌种，制成兽用19活菌苗。1946年苏联研究人员从19号菌种的变异菌落中选出一种纯系光滑型菌体，称之为BA-19菌苗，1951年正式用于人群接种。104M菌苗是上世纪五十年代在苏联中部地区病牛的胎盘中分离出一株牛种菌，该菌种编号为104M(Mockba的缩写)。小量豚鼠实验证明该菌种对动物的免疫原性优于BA-19，毒力较BA-19强，在之后的十余年中苏联学者利用实验动物和家畜对104M进行了大量的研究，并少量用于人体的研究，证明它在一定条件下使用，对人和动物有效。我国引用该菌种后，于1959年-1965年进行了系统的研究，证明对人群预防布鲁氏菌病感染有效，优于BA-19菌种。1965年我国正式批准生产人用皮上划痕104M布鲁氏菌活疫苗。但是，使用过程中发现104M菌苗和BA-19一样，能使被接种的机体产生过敏反应，表现局部皮试敏感性增高及出现某些临床症状，存在着一些严重的问题而逐渐不被使用。其主要问题为：一、接种采用皮肤划痕的方法，不仅疼痛而且让人难以接受；二、因其是弱毒疫苗株，接种后副反应也较大，可致接种人员感染；三、免疫后与自然感染无法区分，严重地影响着对布病的诊断与检疫工作。布鲁氏菌的毒力因子与布鲁氏菌病的发病及免疫机制、治疗及预防等均关系密切。由于现代分子生物学领域的不断进步，对布鲁氏菌毒力因子的认识也逐渐深化。目前公认的布鲁氏菌毒力相关因子有：脂多糖合成基因、BvrR/BvrS双组分调控蛋白基因、IV型分泌系统、H2O2酶基因、超氧歧化酶基因、外膜蛋白、热休克蛋白等。Perosamine合成酶(per，GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖-4氨基转移酶)Perosamine合成酶基因已经被克隆测序。在霍乱弧菌(V.choLerae)中，GDP-4-酮-6脱氧甘露糖胺是由6-磷酸果糖，通过4个中间体实现的：6-磷酸甘露糖、1-磷酸甘露糖、GDP-甘露糖、4-酮-6脱氧甘露糖，最终有Perosamine合成酶转化成为GDP-perosamine。因为在霍乱弧菌和羊布鲁氏菌中最后一步的合成途径是一致的，所以假定在早期过程也是一致的。在布鲁氏菌GDP-perosamine作为底物添加甲酰基，然后聚合成O侧链，转运到周质空间，转化为脂质A内核低聚糖，进而运输到细胞表面。Per完全裂解使16M马耳他布鲁氏菌丧失了O链生物合成的能力。基因替代突变证明转座子插入比自发性突变更能导致出现突变表型。事实上，不仅在细胞表面，细菌细胞质内per裂解产物可保护任何O链产物，证明突变不影响O链转移到外膜，而是影响早期的生物合成。目前公认的传统的布鲁氏菌病的血清学检测方法是虎红平板凝集反应和标准试管凝集反应。这两种方法的检测都是针对布鲁氏菌脂多糖的O-链抗原所产生的O-链抗体，即只要宿主血清中存在O-链抗体，反应则为阳性。因此，目前布鲁氏菌病传统的检测手段无法区别人畜是疫苗接种还是野毒株感染。粗糙型(R型)布鲁氏菌一般都被视为弱毒株，真正的R型布鲁氏菌因缺失O-链抗原，被其感染的动物体内也无抗O-链的特异性抗体，根据这些特点可以用传统的血清学方法区分疫苗接种和野毒感染的动物。目前用作疫苗的牛种粗糙型布氏杆菌S19、45/20和RB51是在体外反复传代使其发生从S到R型的变异的方法获得的。但是，用这种方法获得的粗糙型菌株具有毒力恢复的潜在风险。为了使S型布鲁氏菌菌株从根本上变成R型布鲁氏菌菌株，研究者们目前主要是利用基因敲除等分子生物学手段破坏或缺失S-LPS合成酶的相关基因，使得该菌株最终不能产生O-链抗体。现在己经发现与S-LPS合成相关的基因主要包括：WboA、pgm、gmd、per、wbkA、wbkC等，相关的重组菌株已构建成功，其毒力和免疫保护试验结果还需大量的动物试验来证实。基因缺失疫苗作为新型的基因工程疫苗之一，对预防和控制布病具有广阔的研究前景。目前布鲁氏菌弱毒疫苗株是实践应用中控制布鲁氏菌最有效的疫苗，但多数疫苗表现出一定的毒性，当在怀孕前使用会引起流产，并且免疫所产生的抗体难以与自然感染区别。因此，急需研制一种能够用于人的安全、有效免疫的布鲁氏菌疫苗。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种布鲁氏菌104M疫苗株敲除Per基因的重组菌及应用。本专利技术提供的重组菌，为降低和/或抑制布鲁氏菌104M中Per蛋白活性得到的菌。上述重组菌中，所述降低和/或抑制布鲁氏菌104M中Per蛋白活性为抑制或沉默布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因的表达。上述重组菌中，所述抑制或沉默布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因的表达为敲除布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因。上述重组菌中，所述敲除布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因为将布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因替换为抗性基因。上述重组菌中，所述布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因替换为抗性基因均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或自杀质粒介导的同源重组。上述重组菌中，所述布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因替换为抗性基因为将含有抗性基因的同源重组片段导入布鲁氏菌104M中；所述含有抗性基因的同源重组片段包括Per蛋白编码基因上游同源臂、抗性基因和Per蛋白编码基因下游同源臂。上述重组菌中，所述含有抗性基因的同源重组片段通过重组载体导入布鲁氏菌104M中；所述重组载体为将含有抗性基因的同源重组片段插入表达载体得到的载体。上述重组菌中，所述抗性基因为kan；所述含有所述抗性基因的同源重组片段的核苷酸序列为序列1。上述的重组菌在制备如下1)-5)中任一种产品中的应用也是本专利技术保护的范围：1)、布鲁氏菌减毒疫苗；2)、布鲁氏菌疫苗；3)、促进CD3+、CD4+和/或CD8+细胞增加产品；4)、提高CD4+细胞与CD8+细胞的数量比产品；5)、提高细胞因子IL-2的含量和/或降低细胞因子IL-4含量产品。本专利技术的另一个目的是提供一种如下1)-5)中任一种产品。本专利技术提供的产品，其活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组菌，为降低和/或抑制布鲁氏菌104M中Per蛋白活性得到的菌。

【技术特征摘要】
1.重组菌，为降低和/或抑制布鲁氏菌104M中Per蛋白活性得到的菌。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述降低和/或抑制布鲁氏菌104M中Per蛋白活性为抑制或沉默布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因的表达。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述抑制或沉默布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因的表达为敲除布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述敲除布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因为将布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因替换为抗性基因。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因替换为抗性基因均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或自杀质粒介导的同源重组。6.根据权利要求4或5所述的重组菌，其特征在于：所述布鲁氏菌104M中Per蛋白编码基因替换为抗性基因为将含有抗性基因的同源重组片段导入布鲁氏菌104M中；所述含有抗性基因的同源重组片段包括Per蛋白编码基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：李山虎，王秉翔，周建光，王莹，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11