水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法技术

本发明专利技术提供一种水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法，所述雄性不育基因CSA编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用具体是，采用基于CRISPR/Cas9系统敲除、改变或抑制CSA基因，使得常规水稻品种中的CSA基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。所述定点敲除方法为分别利用基于CH-CRISPR/Cas9系统的CC-CSA-1载体和基于Gateway-CRISPR/Cas9系统的GC-CSA-1载体对水稻雄性不育基因CSA进行定向基因编辑。本发明专利技术为创造基于水稻雄性不育基因CSA的雄性不育系种质资源、水稻两系杂交制种提供一种高效的敲除方法和育种方式。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水稻育种
，涉及水稻OsCSA基因的应用及其定点敲除方法，具体地，涉及一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA定点敲除方法及利用该方法在不同水稻品种中的创制雄性不育系的应用。
技术介绍
雄性不育系为水稻杂交制种技术提供关键的育种材料，在全世界范围内展开了广泛的研究。水稻花粉碳饥饿(CarbonStarvedAnther，csa)基因编码一个参与水稻花药发育和糖分配调控的R2R3MYB转录因子，主要在花药绒毡层细胞和糖转运维管组织中表达(Zhangetal,2010)。CSA基因的突变会造成水稻光敏雄性不育，表现出在短光照下雄性不育、长日照下恢复可育的特征；此外，csa不育系和恢复系JP69杂交产生的F1代具有杂种优势(Zhangetal,2013)，因此，基于csa的光敏雄性不育系，可用于水稻两系杂交稻制种，应用前景广阔。CRISPR/Cas9(成簇、规律间隔短回文重复序列及相关蛋白)系统是近几年出现的基因组编辑新技术，在各种生物和细胞等领域都有广泛的研究和应用。CRISPR/Cas9系统是一种源于原核生物抵御噬菌体、质粒等入侵长期进化的获得性免疫系统，其在指导RNA下完成对外源遗传物质的降解。CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白与sgRNA形成复合体，切割与sgRNA上spacer互补的基因组DNA序列，产生DNA双链断裂(DSB)，激活细胞启动DNA损伤修复机制，通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)方式引入突变。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系统技术具有设计简单、构建快速、突变效率高、多把点同时编辑等优势。目前，水稻雄性不育系的创制主要是通过杂交将不育基因或位点导入其他水稻品种中，但是转育周期较长、过程较复杂、劳动成本大。通过CRISPR/Cas9系统的靶向修饰直接对水稻CSA基因进行定点突变或敲除，创制基于CSA基因的水稻雄性不育株系，大大缩短育种周期。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种水稻OsCSA基因(即水稻雄性不育基因CAS)的应用及其定点敲除方法，提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻雄性不育基因CSA定点敲除方法及利用该方法在不同水稻品种中的创制雄性不育系的应用，利用CSA基因及其蛋白参与水稻花药发育调控的特点及CRISPR/Cas9系统的基因组靶向修饰，通过突变CSA基因核苷酸序列筛选水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：第一方面，本专利技术涉及一种水稻OsCSA基因的应用，所述OsCSA基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的应用具体是，采用基于CRISPR/Cas9系统敲除、改变或抑制CSA基因，使得常规水稻品种中的CSA基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。优选地，所述CRISPR/Cas9系统为II类CRISPR/Cas9载体系统。优选地，所述CRISPR/Cas9载体系统为：基于psgR-Cas9-Os和pCAMBIA1300载体的CH－CRISPR/Cas9构建、基于pOs-sgRNA和pH-Ubi-Cas9载体的Gateway-CRISPR/Cas9构建中的一种或两种；所述CRISPR/Cas9载体系统采用的靶序列为CSA序列中任一包括XXXNGG的核酸序列；其中，XXX为19－20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。优选地，所述常规水稻品种为粳稻品种9522，交源5B，或空育13。第二方面，本专利技术涉及一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻OsCSA基因的定点敲除方法，所述定点敲除方法包括如下步骤：a)构建含有水稻OsCSA基因靶序列CSA-1的psgR-Cas9-Os表达盒CH-CSA-1质粒；b)酶切CH-CSA-1质粒，将含有CSA-1片段的序列构建到pCAMBIA1300质粒中形成CC-CSA-1质粒；c)将含CC-CSA-1质粒的根癌农杆菌转入水稻品种中；其中，所述靶序列CSA-1为位于SEQIDNO.2的第49位至第68位的核酸序列；所述CC-CSA-1质粒含有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。第三方面，本专利技术涉及一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻OsCSA基因的定点敲除方法，所述定点敲除方法包括如下步骤：a)构建含有水稻OsCSA基因靶序列CSA-1的pOs-sgRNA表达盒sgRNA-CSA-1质粒；b)通过gateway克隆将含有CSA-1片段的序列构建到pH-Ubi-Cas9质粒中形成GC-CSA-1质粒；c)将含GC-CSA-1质粒的根癌农杆菌转入水稻品种；其中，所述靶序列CSA-1为位于SEQIDNO.2的第49位至第68位的核酸序列；所述GC-CSA-1质粒含有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。第四方面，本专利技术涉及一种水稻OsCSA基因定点敲除获得水稻雄性不育株系的方法，所述方法包括如下步骤：取常规水稻品种，采用如权利要求3或4所述的方法进行处理，之后进行筛选鉴定，进而获得水稻雄性不育株系。采所述定点敲除方法在所述常规水稻品种中表达是通过所述CC-CSA-1质粒将编码所述CC-CSA-1的基因导入所述常规水稻品种中实现的；所述采用权利要求4所述定点敲除方法在所述常规水稻品种中表达是通过所述GC-CSA-1质粒将编码所述GC-CSA-1的基因导入所述常规水稻品种中实现的。优选地，所述筛选为转化植株筛选，具体包括如下步骤：通过CRISPR/Cas9系统载体自身的通用引物M13F和所述CSA-1靶序列引物的聚合酶链式反应扩增实现的。优选地，所述鉴定为突变植株鉴定，具体包括如下步骤：通过将CSA基因的特异性引物扩增CSA基因的基因组片段进行测序实现的。优选地，所述常规水稻品种为粳稻品种9522，交源5B，或空育13。本专利技术的基于CRISPR/Cas9系统水稻OsCSA基因定点敲除方法，具体为分别利用基于CH-CRISPR/Cas9系统的CC-CSA-1载体和基于Gateway-CRISPR/Cas9系统的GC-CSA-1载体对水稻雄性不育基因CSA实现定向基因编辑；所述CC-CSA-1载体为特异性修饰所述水稻OsCSA基因内CSA-1靶序列的CH-CRISPR/Cas9系统；所述CC-CSA-1载体的靶序列CSA-1由SEQIDNo.2序列的第49位至第68位的核酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻OsCSA基因的应用，其特征在于，所述OsCSA基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用具体是，采用基于CRISPR/Cas9系统敲除、改变或抑制CSA基因，使得常规水稻品种中的CSA基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。

【技术特征摘要】
1.一种水稻OsCSA基因的应用，其特征在于，所述OsCSA基因编码的氨基酸序列
如SEQIDNO.1所示，所述的应用具体是，采用基于CRISPR/Cas9系统敲除、改变或抑
制CSA基因，使得常规水稻品种中的CSA基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株
系。
2.根据权利要求1所述的水稻OsCSA基因的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9
系统为II类CRISPR/Cas9载体系统。
3.根据权利要求1或2所述的水稻OsCSA基因的应用，其特征在于，所述
CRISPR/Cas9载体系统为：基于psgR-Cas9-Os和pCAMBIA1300载体的CH－CRISPR/Cas9
构建、基于pOs-sgRNA和pH-Ubi-Cas9载体的Gateway-CRISPR/Cas9构建中的一种或两
种；
所述CRISPR/Cas9载体系统采用的靶序列为CSA序列中任一包括XXXNGG的核酸序
列；其中，XXX为19－20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。
4.一种基于CRISPR/Cas9系统的水稻OsCSA基因的定点敲除方法，其特征在于，
所述定点敲除方法包括如下步骤：
a)构建含有水稻OsCSA基因靶序列CSA-1的psgR-Cas9-Os表达盒CH-CSA-1质粒；
b)酶切CH-CSA-1质粒，将含有CSA-1片段的序列构建到pCAMBIA1300质粒中形成
CC-CSA-1质粒；
c)将含CC-CSA-1质粒的根癌农杆菌转入水稻品种中；
其中，所述靶序列CSA-1为位于SEQIDNO.2的第49位至第68位的核酸序列；所
述CC-C...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大兵，袁政，李全林，梁婉琪，陈明姣，罗治靖，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31