敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法技术

本发明专利技术公开了敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法，经过构建针对Wnt3a基因的Cas9慢病毒载体、HepG2细胞的培养与传代、目的细胞慢病毒感染与筛选、错配酶法验证基因敲除效率、细胞蛋白分析、CCK‑8法检测细胞增殖的步骤完成对Wnt3a基因的敲除及验证。本发明专利技术的优点在于：本发明专利技术通过首次构建Cas9双载体慢病毒系统敲除Wnt3a基因,Crispr/Cas9 是一种能够对任何物种基因组的特定位点进行精确编辑的技术，使用该技术能够进行细胞水平单基因或多基因敲除，该方法比其它基因编辑技术靶向精确性更高，RNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切，并可实现对靶基因多个位点同时敲除，载体构建实验周期短，节省大量时间和成本，并且无物种限制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学领域，具体涉及一种敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法。
技术介绍
肝细胞肝癌（HepatocellularCarcinoma,HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，位列肿瘤相关死因的第三位。HCC的发生发展是多病因、多基因、多步骤及多因子协同的复杂过程，涉及到癌基因激活，抑癌基因失活及胚胎期某些癌基因重新复活等多信号通路和基因调控。肝细胞肝癌以手术治疗为主，辅之化学治疗、局部治疗等。早期肝癌可选择切除术及肝脏移植，但大部分患者就诊时已失去手术治疗机会。因此，早期诊断和有效治疗至关重要。Wnt信号通路被认为与HCC的发生发展密切相关，尤其是经典Wnt/β-catenin信号途径的异常激活，是HCC发病机制的关键环节。作为经典途径中的Wnt3a蛋白过表达即可作为肝癌早期诊断标志，又可作为肝癌预后相关的新靶点，具有开发与应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种具有开发与应用前景的敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法，其创新点在于：经过构建针对Wnt3a基因的Cas9慢病毒载体、HepG2细胞的培养与传代、目的细胞慢病毒感染与筛选、错配酶法验证基因敲除效率、细胞蛋白分析、CCK-8法检测细胞增殖的步骤完成对Wnt3a基因的敲除及验证；所述构建针对Wnt3a基因的Cas9慢病毒载体的具体步骤为：构建Cas9双载体慢病毒，包含Lenti-sgRNA-EGFP病毒2个，分别表达靶基因sgRNA序列及对照sgRNA序列，滴度在1E+8以上；Lenti-CAS9-puro病毒1个，表达CAS9蛋白，带puro抗性，滴度在1E+8以上；所述HepG2细胞的培养与传代的具体步骤包括细胞复苏和细胞传代。进一步的，所述HepG2细胞的培养与传代步骤中的细胞复苏的具体步骤为：（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻；（2）完全解冻后，在1000rpm环境下，离心2min；（3）然后采用70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台；（4）吸去冻存液上清，加入1ml新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3ml完全培养基的细胞培养瓶中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2培养箱中培养；（5）次日更换一次培养液后再继续培养。进一步的，所述HepG2细胞的培养与传代步骤中的细胞传代的具体步骤为：1）将生长90%汇合的细胞进行传代，弃去旧培养液，加入2ml灭菌的D-Hanks溶液，洗涤细胞生长面；2）然后弃去该溶液，加入1ml胰酶消化液，在37℃环境下消化1-2min，直到细胞完全消化下来；3）加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打，将壁上的细胞冲洗下来；4）混匀细胞后分至两个新的细胞培养瓶中，补足完全培养基至4ml，继续培养。进一步的，所述目的细胞慢病毒感染与筛选的具体步骤为：a.将未感染慢病毒待筛选空细胞接种于6孔板中至70-80%融合度；b.待细胞贴壁后，加入puromycin药物进行空细胞致死最低浓度筛选，1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml进行筛选，得出药物处理48h后细胞全部死亡的最低药物浓度；c.培养至对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液；d.将细胞数为5×104/ml的细胞悬液接种于6孔板中，在37℃环境下5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到30%；e.根据细胞MOI值，加入病毒，12h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基；f.48小时后，加入puromycin药物筛选48h，得到稳定表达CAS9的混合克隆；g.筛选后的细胞即时观察细胞状态，保证细胞状态良好；h.再次铺板，按照慢病毒感染细胞步骤感染表达sgRNA的慢病毒；i.染3天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，荧光效率在80%左右的细胞开始进行后续实验。进一步的，所述错配酶法验证基因敲除效率的具体步骤为：（一）DNA抽提：收集成功感染的细胞，使用基因组DNA抽提试剂盒抽提基因组DNA；（二）PCR扩增：围绕sgRNA结合位点，设计一对基因组PCR引物，按照如下体系进行PCR反应：2×TaqPlusMasterMix10μL，引物F0.5μL，引物R0.5μL，基因组DNA30ng，加双蒸水至20μL；PCR反应程序设置：94℃预变性90s，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s/kb，重复变性，退火，延伸步骤35个循环，72-98℃融解，自然冷却至40℃以下；（三）酶切筛选阳性克隆：在灭菌PCR管中配制如下反应体系：PCR产物2μL，DetecaseBuffer2μL，Detecase2μL，加双蒸水至10μL，45℃反应20min，然后立即向上述10μL体系内加入2μL终止缓冲液，随后进行2%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳105V，45min，电泳结束后，凝胶成像分析仪拍照。进一步的，所述细胞蛋白分析的具体步骤为：I.蛋白抽提和浓度测定：用PBS冲洗贴壁细胞，用刮板刮下，每个样本取2×106个细胞于冰上裂解，按蛋白抽提试剂盒操作步骤提取总蛋白，以BCA法测定浓度，稀释到最佳上样量2μg/μL，收集到的蛋白立即使用或者-80℃环境下保存待用；II.免疫印迹试验：制备10%SDS聚丙烯酰胺凝胶分离胶和5%浓缩胶，取20μg待测蛋白样品放入EP管中加5×SDS上样缓冲液，煮沸5min使蛋白变性，向电泳槽内加入足量电泳缓冲液，所述电泳缓冲液的配方为：Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10mL，ddH2O1000mL，上样，电泳恒压60V×40min，后110V×60min，结束后将样品放入有转膜缓冲液的转移槽内进行转膜，所述转膜缓冲液的配方为：Tris3.02g，甘氨酸14.4g，100%甲醇200mL，ddH2O800mL，恒流300mA×110min；待蛋白转移至PVDF膜后拿出，用洗涤缓冲液漂洗5min，共漂洗4次，所述洗涤缓冲液的配方为：TBS-T，Tris2.42g，NaCl8.0g，Tween-200.5mL，ddH2O1000mL，加浓HCl120mL使其pH值为7.5，室温下5%脱脂牛奶封闭液脱色摇床封闭1h；TBS-T漂洗5min，共漂洗4次，加入采用Dako抗体稀释液稀释1000倍的鼠抗人Wnt3a及采用Dako抗体稀释液稀释2000倍的鼠抗人β-actin抗体作为内参，4℃环境下过夜，TBS-T漂洗5min，漂洗4次，采用Dako抗体稀释液稀释1000倍的辣根过氧化物酶HP标记的羊抗鼠IgG二抗37℃孵育1h，洗涤后ECL显色并拍照。进一步的，所述CCK-8法检测细胞增殖的具体步骤为：设空白组，阴性对照组，实验组，取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化制备细胞悬液，分别接种于96孔板，每孔100μL，将培养板放在37℃，5%CO2的培养箱中预培养，分别于既定时间点取出换液，每孔添加10μLCCK-8试剂，继续在培养箱中孵育1-4h，采用酶标仪检测A450值。本专利技术的有益效果如下：本专利技术通过首次构建Cas9双载体慢病毒系统敲除Wnt3a基因,本文档来自技高网...

【技术保护点】
敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法，其特征在于：经过构建针对Wnt3a基因的Cas9慢病毒载体、HepG2细胞的培养与传代、目的细胞慢病毒感染与筛选、错配酶法验证基因敲除效率、细胞蛋白分析、CCK‑8法检测细胞增殖的步骤完成对Wnt3a基因的敲除及验证；所述构建针对Wnt3a基因的Cas9慢病毒载体的具体步骤为：构建Cas9双载体慢病毒，包含Lenti‑sgRNA‑EGFP病毒2个，分别表达靶基因sgRNA序列及对照sgRNA序列，滴度在1E+8以上； Lenti‑CAS9‑puro病毒1个，表达CAS9蛋白，带puro抗性，滴度在1E+8 以上；所述HepG2细胞的培养与传代的具体步骤包括细胞复苏和细胞传代。

【技术特征摘要】
1.敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法，其特征在于：经过构建针对Wnt3a基因的Cas9慢病毒载体、HepG2细胞的培养与传代、目的细胞慢病毒感染与筛选、错配酶法验证基因敲除效率、细胞蛋白分析、CCK-8法检测细胞增殖的步骤完成对Wnt3a基因的敲除及验证；所述构建针对Wnt3a基因的Cas9慢病毒载体的具体步骤为：构建Cas9双载体慢病毒，包含Lenti-sgRNA-EGFP病毒2个，分别表达靶基因sgRNA序列及对照sgRNA序列，滴度在1E+8以上；Lenti-CAS9-puro病毒1个，表达CAS9蛋白，带puro抗性，滴度在1E+8以上；所述HepG2细胞的培养与传代的具体步骤包括细胞复苏和细胞传代。2.根据权利要求1所述的敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法，其特征在于：所述HepG2细胞的培养与传代步骤中的细胞复苏的具体步骤为：从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻；完全解冻后，在1000rpm环境下，离心2min；然后采用70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台；吸去冻存液上清，加入1ml新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3ml完全培养基的细胞培养瓶中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2培养箱中培养；次日更换一次培养液后再继续培养。3.根据权利要求1所述的敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法，其特征在于：所述HepG2细胞的培养与传代步骤中的细胞传代的具体步骤为：将生长90%汇合的细胞进行传代，弃去旧培养液，加入2ml灭菌的D-Hanks溶液，洗涤细胞生长面；然后弃去该溶液，加入1ml胰酶消化液，在37℃环境下消化1-2min，直到细胞完全消化下来；加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打，将壁上的细胞冲洗下来；混匀细胞后分至两个新的细胞培养瓶中，补足完全培养基至4ml，继续培养。4.根据权利要求1所述的敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法，其特征在于：所述目的细胞慢病毒感染与筛选的具体步骤为：将未感染慢病毒待筛选空细胞接种于6孔板中至70-80%融合度；待细胞贴壁后，加入puromycin药物进行空细胞致死最低浓度筛选，1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml进行筛选，得出药物处理48h后细胞全部死亡的最低药物浓度；培养至对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液；将细胞数为5×104/ml的细胞悬液接种于6孔板中，在37℃环境下5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到30%；根据细胞MOI值，加入病毒，12h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基；48小时后，加入puromycin药物筛选48h，得到稳定表达CAS9的混合克隆；筛选后的细胞即时观察细胞状态，保证细胞状态良好；再次铺板，按照慢病毒感染细胞步骤感染表达sgRNA的慢病毒；感染3天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，荧光效率在80%左右的细胞开始进行后续实验。5.根据权利要求1所述的敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法，其特征在于：所述错配酶法验证基因敲除效率的具体步骤为：（一）DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚登福，潘刘翃，姚敏，王理，邱历伟，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32