出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，是将出芽短梗霉菌株中的alb1基因的全部或部分编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。所述潮霉素B抗性基因盒包含：出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF和潮霉素B抗性基因HygR；所述出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述潮霉素B抗性基因序列hygR序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。将本发明专利技术所述突变株用于微生物多糖发酵生产，该突变株不产生黑色素，可显著提高纯化过程中多糖收率和多糖品质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用。
技术介绍
出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)是一类类酵母真菌，具有酵母状和真菌菌丝体两种形态，因其产生大量黑色素，又被称为黑酵母。出芽短梗霉发酵能产生胞外多糖、酶、抗菌素、单细胞蛋白等多种产物，尤其是所产生的普鲁兰多糖具有极佳的成膜性、阻氧性、可塑性、稳定性、粘结性和易自然降解等许多独特的理学和生物学特性，无毒无害，对人体无任何副作用，可广泛地应用于医药、食品、化妆品、烟草、采油等众多领域，是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品。由于出芽短梗霉发酵过程中合成大量黑色素，一半以上的黑色素会分泌到发酵液中，与胞外多糖紧密结合，给多糖的纯化和精制带来极大困难，不但降低多糖收率，而且严重影响产品品质。因此，获得不产黑色素的出芽短梗霉菌株是普鲁兰多糖工业化生产的必然需求。构建出芽短梗霉无色素菌株的方法有物理诱变、化学诱变、基因工程构建等。诱变的方法具有简单、快捷、高效的特点，但诱变是一个随机的过程，缺乏方向性，而且诱变菌株传代稳定性差，在发酵过程中极易产生回复突变。基因工程构建菌株具有可操控的方向性，而且基因敲除获得的菌株性状非常稳定，基本不会发生回复突变，在工业微生物改造中得到了大量应用。目前，国内外研究机构普遍采取诱变的方法进行菌株构建，但基因工程构建出芽短梗霉无色素菌株尚未见报道。出芽短梗霉黑色素属于二羟萘(DHN)黑色素，但出芽短梗霉黑色素体内合成途径及相关基因尚未有报道。因此，如何通过基因工程的方法构建出芽短梗霉无色素菌株是目前的技术难点所在。出芽短梗霉无色素菌株的构建研究对于出芽短梗霉的工业化应用具有重要的意义。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的一个目的是提供一株出芽短梗霉alb1基因敲除突变株。本专利技术提供的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，是将出芽短梗霉菌株中的alb1基因的全部或部分编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。优选的，是将alb1基因从第1位至1911位之间的编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。优选的，所述出芽短梗霉菌株为菌株As3.3984，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为3.3984。上述As3.3984菌株中的alb1基因的全部编码基因序列如序列表中SEQIDNO.1所示。所述潮霉素B抗性基因盒包含：出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF和潮霉素B抗性基因HygR。所述出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF的序列如序列表中SEQIDNO.2所示；所述潮霉素B抗性基因序列hygR序列如序列表中SEQIDNO.3所示。所述潮霉素B抗性基因HygR来源于大肠杆菌，将启动子替换为出芽短梗酶来源的高效启动子PTEF，目的是使该基因能在出芽短梗酶中正常表达。本专利技术的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，命名为出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)Mut，已于2016年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCCNO.12509。为方便说明，在本专利技术的后续表述中将“出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)Mut”记为“As3.3984Δalb1”。本专利技术的另一目的是提供一种构建上述出芽短梗霉alb1基因敲除突变株的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：(1)合成含alb1左同源臂-潮霉素B抗性基因盒-alb1右同源臂的重组片段，重组片段的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；(2)将步骤(1)的重组片段连接到pUC18质粒上的EcoRI位点，得到alb1基因敲除质粒；(3)将alb1基因敲除质粒转化到出芽短梗霉感受态细胞中，通过潮霉素B抗性筛选得到抗性菌株；对抗性菌株进行鉴定，筛选得到敲除alb1基因的突变株。步骤(1)中，所述重组片段采用全基因合成的方法进行合成。步骤(3)中，利用电转化的方法将alb1基因敲除质粒转化到出芽短梗霉感受态细胞中。步骤(3)中，敲除alb1基因的突变株的筛选方法为：根据SEQIDNO.4序列合成可以扩增潮霉素B抗性基因的引物hyg-1和hyg-2，如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；根据出芽短梗霉As3.3984基因组中alb1左同源臂左侧序列设计引物out-1，如SEQIDNO.7所示，根据alb1右同源臂右侧序列的反向互补序列设计引物out-2，如SEQIDNO.8所示。用hyg-1/hyg-2和out1-1/out-2两对引物通过PCR的方法对抗性菌株进行鉴定。上述出芽短梗霉alb1基因敲除突变株在制备微生物多糖中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的第三个目的是提供一种制备微生物多糖的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：在多糖发酵培养基中发酵培养上述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，发酵液离心，收集上清液，向上清液中加入工业乙醇沉淀多糖，离心，收集沉淀，干燥，纯化，即得微生物多糖。所述多糖发酵培养基的组成为：蔗糖100.0g/L，酵母膏2.0g/L，NaCl1.0g/L，MgSO4.7H2O0.2g/L，K2HPO45.0g/L，(NH4)2SO40.6g/L，pH6.5，115℃灭菌30分钟。发酵培养的条件为：28℃震荡培养72小时。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术首次利用基因敲除技术对出芽短梗霉的alb1基因编码区进行了部分敲除，经基因敲除后，细胞不能合成黑色素。传统的出芽短梗霉发酵过程中黑色素会分泌到发酵液中并与胞外多糖紧密结合，给多糖的纯化和精制带来困难，采用本专利技术的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株进行多糖的生产，发酵过程中无黑色素的产生，能明显提高多糖的纯化收率和产品品质。经试验证明，采用本专利技术的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株进行多糖的生产，与原始菌相比，多糖的纯化收率和纯化后多糖产量能分别提高18.0％和21.4％以上。(2)本专利技术构建的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，为出芽短梗霉的工业化应用打下了良好的基础。附图说明图1：本专利技术所述出芽短梗霉alb1基因敲除突变株PCR鉴定电泳图；其中，M.DNAladder；1.以As3.3984基因组为模板，以hyg-1/hyg-2为引物对的PCR产物；2.以As3.3984Δalb1基因组为模板，以hyg-1/hyg-2为引物对的PCR产物；3.以As3.3984基因组为模板，以out-1/out-2为引物对的PCR产物；4.以As3.3984Δalb1基因组为模板，以out-1/out-2为引物对的PCR产物；图2：本专利技术所述出芽短梗霉原始菌As3.3984和突变株As3.3984Δalb1发酵液及发酵生产的微生物多糖。图中：A.As3.3984发酵液；B.As3.3984Δalb1发酵液；C.As3.3984发酵生产的多糖；D.As3.3984Δalb1发酵生产的多糖。具体实施方式下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，其特征在于，是将出芽短梗霉菌株中的alb1基因的全部或部分编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒；优选的，是将alb1基因从第1位至1911位之间的编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。

【技术特征摘要】
1.一株出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，其特征在于，是将出芽短梗霉菌株中的alb1基因的全部或部分编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒；优选的，是将alb1基因从第1位至1911位之间的编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。2.如权利要求1所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，其特征在于，所述潮霉素B抗性基因盒包含：出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF和潮霉素B抗性基因HygR；所述出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF的序列如序列表中SEQIDNO.2所示；所述潮霉素B抗性基因序列hygR序列如序列表中SEQIDNO.3所示。3.如权利要求1或2所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，其特征在于，所述出芽短梗霉菌株为菌株As3.3984。4.如权利要求3所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，已于2016年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCCNO.12509。5.权利要求1-4任一项所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成含alb1左同源臂-潮霉素B抗性基因盒-alb1右同源臂的重组片段，重组片段的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；(2)将步骤(1)的重组片段连接到pUC18质粒上的EcoRI位点，得到alb1基因敲除质粒；(3)将alb1基因敲除质粒转化到出芽短梗霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金华，刘飞，朱希强，张林军，郝荣华，袁超，张祥奎，侯重文，张秀华，凌沛学，
申请(专利权)人：山东省药学科学院，山东福瑞达医药集团公司，
类型：发明
国别省市：山东;37