CRISPR/Cas9 靶向敲除人PD‑1基因及其特异性gRNA制造技术

本发明专利技术属于分子生物学与生物医学技术领域，具体地说本发明专利技术涉及基于CRISPR/Cas9系统的gRNA序列及其组合在敲除人PD‑1基因的应用以及肿瘤治疗中的应用。本发明专利技术根据CRISPR/Cas9的设计原则，在人基因组中设计出25个靶点，然后将其分别构建在px458载体上，并从中筛选得到18个向导RNA（gRNA）。在人T淋巴细胞中利用这18个gRNA介导的CRISPR/Cas9系统，可以有效的敲除人PD‑1基因，该系统操作简便、敲除效率高，适用于多种肿瘤细胞模型。本发明专利技术涉及的gRNA有望在肿瘤的细胞治疗中得到应用。

CRISPR/Cas9 targeting human PD gene knockout 1 and specificity gRNA

The invention belongs to the field of molecular biology and biomedical technology, specifically the invention relates to a gRNA sequence of CRISPR/Cas9 system and its application in portfolio based on the application of PD 1 in addition to knock gene and the treatment of tumor. According to the design principle of CRISPR/Cas9, the invention designs 25 targets in the human genome, then constructs them on a px458 carrier, and selects 18 guides RNA (gRNA) from them. The use of the 18 CRISPR/Cas9 system mediated by gRNA in human T lymphocytes, can effectively knockdown of PD gene 1, the system is easy to operate, knocking out the high efficiency, applicable to a variety of tumor cell model. The present invention relates to gRNA and is hopeful to be applied in tumor cell therapy.

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas9靶向敲除人PD-1基因及其特异性gRNA
本专利技术属于分子生物学与生物医学
，具体涉及CRISPR/Cas9特异性敲除人基因组PD-1基因的方法以及用于特异性靶向人PD-1基因的gRNA。
技术介绍
CRISPR/Cas系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，具体包括三种不同的类型，其中TypeⅡ型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9蛋白外，该系统还包括两条短的CRISPRRNAs（crRNAs）和trans-activatingcrRNAs（tracrRNA）。成熟的crRNA-tracrRNA复合体可以通过碱基互补配对指导Cas9蛋白到靶序列上，并在PAM（protospaceradjacentmotif）附近特异性剪切DNA双链，形成DSB（doublestrandbreak）。DSB可以通过两种途径被修复，一种是非同源重组的末端接合（Non-HomologousEndJoiningNHEJ）DNA修复方式，另一种是同源重组修复（HomologyDirec本文档来自技高网...

【技术保护点】
在CRISPR‑Cas9 特异性敲除人PD‑1基因中用于靶向人PD‑1基因的 gRNA，所述 gRNA 在人PD‑1基因上的靶序列符合 5’‑ N (20)‑NGG3’ 或 者 5’‑CCN‑ N (20)N‑3’的序列排列规则，在人PD‑1基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述 gRNA 在人PD‑1基因的靶向位点位于人PD‑1基因的第2外显子上。

【技术特征摘要】
1.在CRISPR-Cas9特异性敲除人PD-1基因中用于靶向人PD-1基因的gRNA，所述gRNA在人PD-1基因上的靶序列符合5’-N(20)-NGG3’或者5’-CCN-N(20)N-3’的序列排列规则，在人PD-1基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述gRNA在人PD-1基因的靶向位点位于人PD-1基因的第2外显子上。2.根据权利要求1所述的在CRISPR-Cas9特异性敲除人PD-1基因中用于靶向人PD-1基因的gRNA，其特征在于：其对应的DNA序列如序列表SEQIDNO.1-18任意一条序列所示。3.根据权利要求1所述的在CRISPR-Cas9特异性敲除人PD-1基因中用于靶向人PD-1基因的gRNA，其特征在于：该gRNA在肿瘤细胞治疗中具有广泛的应用前景。4.CRISPR-Cas9特异性敲除人PD-1基因的方法，具体涉及如下步骤：4.1如权利要求1-3任意一项所述的gRNA，在其对应...

【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，申友锋，
申请(专利权)人：重庆高圣生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50