敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法技术

一种敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，是通过失活吸水链霉菌XM201基因组中编码pyk的ORF3547，以及编码sdh的ORF1011、ORF6607和ORF4917，导致中心碳代谢流量重排及相关前体积累，使格尔登素的发酵产量得以提高。本发明专利技术通过改变中心碳代谢的代谢流分配，提高了格尔登素前体的供应，以此来提高格尔登素发酵水平，最终格尔登素发酵产量最高提高了一倍，最终产量达到1.3g/L，通过本发明专利技术可显著提高格尔登素的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程，尤其是涉及一种敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法。
技术介绍
放线菌是一类高GC含量的革兰氏阳性菌，目前已知抗生素中有60％以上是由放线菌合成。链霉菌是一类高等放线菌，具有强大的抗生素合成能力和复杂的形态分化，故一直受到人们的关注。聚酮类化合物是一类由放线菌产生的重要的次级代谢产物，其在抗肿瘤、抗寄生虫、抗生素领域都有极其重要的应用。前期的实验已经证明，聚酮类化合物的生物合成主要依赖I型、II型和III型聚酮生物合成基因簇，其主要使用的前体物是乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A等等。而这些前体物质主要是由初级代谢即EMP途径、TCA途径中的中间产物经过几步反应而形成。格尔登素(geldanamycin)属于I型聚酮类抗生素，主要由吸水链霉菌的一些亚种如S.hygroscopicus NRRL 3602、S.hygroscopicus JCM4427产生。格尔登素可以与细胞中的热击蛋白HSP90结合，阻碍其执行分子伴侣功能，抑制肿瘤细胞的分裂，因此有着强的抗肿瘤活性。除此之外，它还有一定的抗革兰氏阳性菌、真菌、疟疾、原生动物和寄生虫的活性。格尔登素虽然有强烈的抗肿瘤活性，但由于它对一般细胞也有毒性且在水中溶解性差，所以不能进行临床应用。目前它的类似物17-[2-(dimethylamino)ethyl]amino-17-demethoxygeldanamycin(17-DMAG)和17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin(17-AAG)都在临床检定阶段。格尔登素也广泛应用在科研中对于热击蛋白HSP90的研究中。格尔登素的生物合成是经起始单元AHBA合成、PKS组装和后修饰步骤这三部分完成的。格尔登素的生物合成基因簇最早在Streptomyces hygroscopicus NRRL 3602中被发现并在2003年被详细地注释。后来又在Streptomyces hygroscopicus 17997中被克隆出来。本微生物代谢国家重点实验室在2015年完成了格尔登素产生菌吸水链霉素XM201(Streptomyces hygroscopicus XM201)的全基因组测序。通过基因组注释和代谢网络分析，我们发现XM201拥有庞大的基因组。它的中心碳代谢途径中，很多基因都具有多个拷贝。目前，我们已经知道前体物的供应会影响到聚酮链的合成，进而影响化合物的最终产量，很多研究通过过量表达相关前体延伸单元合成酶的基因，大大提高了化合物的产量，如红霉素、盐霉素等。然而这些生成延伸单元的前体如1,3-二磷酸甘油酸、乙酰辅酶A、琥珀酰辅酶A等的合成，则是依赖于中心碳代谢的代谢流分配。因此对于格尔登素的合成来说，通过失活中心碳代谢的一些基因，导致前体物质的积累可能是提高抗生素的产量的一种有效途径。为此本专利技术尝试找到通过失活中心碳代谢的相关基因来提高格尔登素产量的方法，为格尔登素工业化规模的扩大和生产成本的降低提供有效的参考。
技术实现思路
本专利技术的目的，就是为了提供一种敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，是通过失活吸水链霉菌XM201基因组中编码pyk的ORF3547，以及编码sdh的ORF1011、ORF6607和ORF4917，导致中心碳代谢流量重排及相关前体积累，使格尔登素的发酵产量得以提高。所述编码pyk的ORF3547的序列如SEQ ID NO.1所示。所述编码sdh的ORF1011的序列如SEQ ID NO.2所示。所述编码sdh的ORF6607的序列如SEQ ID NO.3所示。所述编码sdh的ORF4917的序列如SEQ ID NO.4所示。构建步骤如下：第一步：设计并构建用于ORF3547失活的同源重组质粒载体I；第二步：设计并构建用于ORF1011失活的同源重组质粒载体II；第三步：设计并构建用于ORF6607失活的同源重组质粒载体III；第四步：设计并构建用于ORF4917失活的同源重组质粒载体IV；第五步：将构建得到的四个同源重组质粒载体通过接合转移导入受体菌吸水链霉菌XM201中进行同源重组；第六步：通过对突变株的筛选和阿泊拉霉素抗性验证，并通过PCR产物片段大小的差异筛选得到ORF3547、ORF1011、ORF6607、ORF4917失活的突变株。所述质粒载体I的构建方法是，在质粒pJTU1278的KpnI/XbaI位点插入来自ORF3547的0～750bp区域左侧2025bpPCR片段和来自ORF3547的0～750bp区域右侧2045bp PCR片段，得到的载体通过HindIII位点连入阿泊拉霉素抗性基因；所述质粒载体II的构建方法是，在质粒pJTU1278的KpnI/XbaI位点插入来自ORF1011的上游17bp～基因内677bp区域左侧2068bp PCR片段和来自ORF1011的上游17bp～基因内677bp区域右侧2049bp PCR片段，得到的载体通过HindIII位点连入阿泊拉霉素抗性基因；所述质粒载体III的构建方法是，在质粒pJTU1278的XbaI/HindIII位点插入来自ORF6607的4～624bp区域左侧2078bp PCR片段和来自ORF6607的4～624bp区域右侧2069bp PCR片段，得到的载体通过EcoRI位点连入阿泊拉霉素抗性基因；所述质粒载体IV的构建方法是，在质粒pJTU1278的XbaI/HindIII位点插入来自ORF4917的上游111bp～基因内部720bp区域左侧2144bpPCR片段和来自ORF4917的上游111bp～基因内部720bp区域右侧2176bp PCR片段，得到的载体通过EcoRI位点连入阿泊拉霉素抗性基因。所述发酵是指将链霉菌孢子或者菌丝体接种在种子培养基中于30℃、220rpm的转速下培养36小时后转接发酵培养基发酵6天。所述种子培养基含有质量体积比为1％的葡萄糖、1％的蛋白胨和0.5％的酵母提取物；所述发酵培养基含有质量体积比为3％的淀粉、7％的葡萄糖、4％的黄豆饼粉、0.3％的硫酸铵、1％的碳酸钙、0.001％的氯化钴和0.1％的大豆油。种子培养物按15％的接种量转接于发酵培养基。本专利技术通过在染色体上置换的方法，在基因ORF3547、ORF1011、ORF6607、ORF4917位置上引入基因突变，导致丙酮酸激酶、琥珀酸脱氢酶基因的失活。本专利技术所得到的工程菌株其格尔登素的产量大幅提高。本专利技术通过改变中心碳代谢的代谢流分配，提高了格尔登素前体的供应以此来提高格尔登素发酵水平，最终格尔登素发酵产量最高提高了一倍，最终产量达到1.5g/L，通过本专利技术可显著提高格尔登素的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。本专利技术所涉及的质粒pJTU1278已经在SCI数据库文献《He Y,Wang Z,Bai L,Liang J,Zhou X,Deng Z:Two pHZ1358derivative vectors for efficient gene knockout in Streptomyces.Journal本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，通过失活吸水链霉菌XM201基因组中编码pyk的ORF3547，以及编码sdh的ORF1011、ORF6607和ORF4917，导致中心碳代谢流量重排及相关前体积累，使格尔登素的发酵产量得以提高。

【技术特征摘要】
1.一种敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，通过失活吸水链霉菌XM201基因组中编码pyk的ORF3547，以及编码sdh的ORF1011、ORF6607和ORF4917，导致中心碳代谢流量重排及相关前体积累，使格尔登素的发酵产量得以提高。2.如权利要求书1所述的敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述编码pyk的ORF3547的序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求书1所述的敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述编码sdh的ORF1011的序列如SEQ ID NO.2所示。4.如权利要求书1所述的敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述编码sdh的ORF6607的序列如SEQ ID NO.3所示。5.如权利要求书1所述的敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述编码sdh的ORF4917的序列如SEQ ID NO.4所示。6.如权利要求书1所述的敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，构建步骤如下：第一步：设计并构建用于ORF3547失活的同源重组质粒载体I；第二步：设计并构建用于ORF1011失活的同源重组质粒载体II；第三步：设计并构建用于ORF6607失活的同源重组质粒载体III；第四步：设计并构建用于ORF4917失活的同源重组质粒载体IV；第五步：将构建得到的四个同源重组质粒载体通过接合转移导入受体菌吸水链霉菌XM201中进行同源重组；第六步：通过对突变株的筛选和阿泊拉霉素抗性验证，并通过PCR产物片段大小的差异筛选得到ORF3547、ORF1011、ORF6607、ORF4917失活的突变株。7.权利要求书6所述敲除中心碳代谢基因以提高格尔登素发酵水平的方法，其特征在于，所述质粒载体I的构建方法是，在质粒pJTU1278的KpnI/XbaI位点插入来自ORF3547的0～750bp区域左...

【专利技术属性】
技术研发人员：白林泉，王欣然，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31