一种基因同源重组修复报告系统及建立方法技术方案

本发明专利技术公开一种基因同源重组修复报告系统及建立方法，系统包括报告细胞系和基因同源重组修复模板AAV，报告细胞系为整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK‑293或HT‑1080‑GFP(510_513delAAC)细胞系，GFP(510_513delAAC)基因的序列如SEQ ID NO.1；基因同源重组修复模板AAV为腺相关病毒包装的同源重组修复模板质粒pA2‑GFP‑pMC1TK，pA2‑GFP‑pMC1TK包含不含启动子的GFP和Puro基因。建立方法为包括报告细胞系的建立和基因同源重组修复模板AAV的建立。通过采用基因同源重组修复模板AAV感染报告细胞系的细胞后，用流式细胞术检测基因修复后恢复绿色荧光细胞的比率，以此来评估基因同源重组修复的效率。利用此系统可以在体外快速、有效、高通量筛选靶向HRR相关的分子，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，HRR机制进行深入研究。

【技术实现步骤摘要】
一种基因同源重组修复报告系统及建立方法
本专利技术涉及细胞工程与病毒学领域，涉及一种基因同源重组修复报告系统及建立方法。
技术介绍
细胞基因组在染色体自我复制的过程中由于受到各种内源性或者外源性因素的影响，存在多种形式的损伤，并由此引发一系列细胞学反应。DNA的损伤类型很多，其中以DNA双链断裂(doublestrandbreak，DSB)最为严重。且DNADSB的修复比其他类型的DNA损伤更加困难，不修复则可能导致染色体断裂和细胞死亡，而错误修复则可能导致染色体缺失、重排、转位和倒置等。DNA损伤的不完全修复可导致基因组不稳定，机体细胞为了对抗损伤，进化出多个修复系统来确保基因组的完整性，其中同源重组修复(homologousrecombinationrepair，HRR)是DNADSB损伤修复的主要方式。HRR主要发生在有丝分裂的S期和G2监测点，因DNADSB而导致断裂DNA末端与姊妹染色单体进行结合并进行修复。肿瘤是严重危害人类生命和健康的一类疾病，其发生发展是个复杂过程。基因组的修复对于肿瘤细胞的生长特别重要，而基因HRR对于保持基因组稳定性的必不可少。有研究表明HRR修复缺陷的细胞对于药物，如顺-二氯二氨络铂(Cisplatin)，卡波铂(Carboplatin)和亚硝基脲(Nitrosoureas)超敏感。这提示着，与HRR相关的分子理论上很可能可以成为临床肿瘤治疗的靶标。因此，如何从大量小分子中筛选出靶向HRR相关的分子显得十分有意义，而限制该研究重要的难点是需要建立能在体外快速、有效、高通量的HRR报告系统来达到靶向筛选的目的。专利技术内容本专利技术的目的是建立一种基因同源重组修复报告系统，以解决不能在体外有效、快速、高通量筛选出靶向HRR相关分子的瓶颈，有助于临床肿瘤治疗靶标的筛选，药物开发，HRR机制进行深入研究。具体地，根据本专利技术的一个方面，提供了一种基因同源重组修复报告系统，包括报告细胞系，报告细胞系为整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293或HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系，GFP(510_513delAAC)基因的序列如SEQIDNO.1。GFP(510_513delAAC)基因为GFP(绿色荧光蛋白)基因510bp位置缺失AAC碱基序列而绿色荧光失活的GFP突变体，所述GFP突变体基因由申请人筛选获得。所述报告系统还包括基因同源重组修复模板AAV，其为腺相关病毒(AAV)包装的同源重组修复模板质粒pA2-GFP-pMC1TK，pA2-GFP-pMC1TK载体包含不含启动子的GFP(绿色荧光蛋白)和Puro基因。一种基因同源重组修复报告系统的建立方法，包括报告细胞系的建立：1)构建重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)，重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)包含GFP(510_513delAAC)基因，IRES基因和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因：2)将重组pSin-GFP(510_513delAAC)载体和辅助质粒共转入HEK-293T细胞，获得慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)；3)用慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)感染HEK-293或HT-1080细胞，获得整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293/HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系。重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)的构建方法为：1)筛选出GFP(510_513delAAC)基因；2)用PCR扩增GFP(510_513delAAC)基因，克隆到pSin-EF2-LIN28-Pur载体上，得到重组pSin-GFP(510_513delAAC)载体。pSin-EF2-LIN28-Pur载体的制备方法见http://www.addgene.org/16580，为已知技术。筛选GFP(510_513delAAC)基因的方法为：1)CRISPR/Cas9-GFP-sgRNA载体设计：根据AAV打靶载体同源臂长度要求，在GFP基因530bp处设计sgRNA，sgRNA序列为：CAAGATCCGCCACAACATCG；2)HEK-293-GFP细胞(申请人实验室保存)计数后接种于6孔板，每孔的细胞密度为5.0×105细胞/孔；3)将CRISPR/Cas9-GFP-sgRNA载体转入HEK-293-GFP细胞中，在荧光显微镜下挑选GFP失活的单克隆细胞(即不绿的细胞)培养；4)上述单克隆细胞培养大约15天后消化细胞，提基因组PCR后测序，筛选目标突变基因，即GFP(510_513delAAC)基因。辅助质粒为pVSVg和psPAX2(申请人实验室保存)。慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)，保存于-80℃。获得整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293/HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系的方法为：1)HEK-293或HT-1080细胞计数后接种于6孔板，每孔的细胞密度为3.0×105细胞/孔；2)细胞生长24h后，在6孔板中加入适量的慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)，同时加终浓度为4ug/ml的聚凝胺(polybrene)；3)HEK-293或HT-1080细胞感染慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)12h后换液，48h后传代，稀释后接种到10cm皿，用1ug/ml浓度的抗生素嘌呤霉素(Puromycin)筛选；4)10天后，在显微镜下挑选单克隆细胞，获得整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293或HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系。基因同源重组修复报告系统的建立方法还包括基因同源重组修复模板AAV的制备方法为：1)构建同源重组修复模板AAV质粒pA2-pMC1TK-GFP-Ires-Puro，其包含不含启动子的GFP(绿色荧光蛋白)和Puro基因；2)将质粒pA2-pMC1TK-GFP-Ires-Puro和辅助质粒共转HEK-293T细胞，获得基因同源重组修复模板AAV。构建同源重组修复模板AAV质粒pA2-pMC1TK-GFP-Ires-Puro的方法为：从pSin-GFP-Puro载体(申请人实验室保存)上扩增GFP-Ires-Puro序列(序列如SEQIDNO.2所示)和从PL253载体(制备方法见https://ncifrederick.cancer.gov/Research/Brb/productDataSheets/recombineering/plasmid.aspx)上扩增pMC1-TK序列(序列如SEQIDNO.3所示)，克隆到AAV载体(制备方法见http://www.addgene.org/67634)的ITR序列中间，得到重组pA2-GFP-pMC1TK载体。辅助质粒为pDG(申请人实验室保存)。基因同源重组修复报告系统的建立方法还包括如下步骤：1)用基因同源重组修复模板AAV感染报告细胞系(HEK-293/HT-1080-EGFP(delAAC)细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因同源重组修复报告系统，其特征在于，包括报告细胞系和基因同源重组修复模板AAV，报告细胞系为整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK‑293或HT‑1080‑GFP(510_513delAAC)细胞系，GFP(510_513delAAC)基因的序列如SEQ ID NO.1；基因同源重组修复模板AAV为腺相关病毒包装的同源重组修复模板质粒pA2‑GFP‑pMC1TK，pA2‑GFP‑pMC1TK包含不含启动子的GFP和Puro基因。

【技术特征摘要】
1.一种基因同源重组修复报告系统，其特征在于，包括报告细胞系和基因同源重组修复模板AAV，报告细胞系为整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293或HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系，GFP(510_513delAAC)基因的序列如SEQIDNO.1；基因同源重组修复模板AAV为腺相关病毒包装的同源重组修复模板质粒pA2-GFP-pMC1TK，pA2-GFP-pMC1TK包含不含启动子的GFP和Puro基因。2.一种基因同源重组修复报告系统的建立方法，其特征在于，包括报告细胞系的建立和基因同源重组修复模板AAV的建立，报告细胞系的建立方法为：1)构建重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)，重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)包含GFP(510_513delAAC)基因，IRES基因和嘌呤霉素抗性基因，GFP(510_513delAAC)基因的序列如SEQIDNO.1：2)将重组pSin-GFP(510_513delAAC)载体和辅助质粒共转入HEK-293T细胞，获得慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)；3)用慢病毒pSin-GFP(510_513delAAC)感染HEK-293或HT-1080细胞，获得整合有GFP(510_513delAAC)基因的单克隆HEK-293/HT-1080-GFP(510_513delAAC)细胞系。3.根据权利要求3所述的基因同源重组修复报告系统的建立方法，其特征在于，重组载体pSin-GFP(510_513delAAC)的构建方法为：(1)筛选出GFP(510_513delAAC)基因；(2)用PCR扩增GFP(510_513delAAC)基因，克隆到pSin-EF2-LIN28-Pur载体上，得到重组pSin-GFP(510_513delAAC)载体。4.根据权利要求3所述的基因同源重组修复报告系统的建立方法，其特征在于，筛选GFP(510_513delAAC)基因的方法为：1)CRISPR/Cas9-GFP-sgRNA设计：在GFP基因530bp处设计sgRNA，sgRNA序列为：SEQIDNO.4；2)HEK-293-GFP细胞计数后接种于6孔板，每孔的细胞密度为5.0×105细胞/孔；3)将CRISPR/Cas9-GFP-sgRNA载体转入HEK-293-GFP细胞中，在荧光显微镜下挑选GFP失活的单克隆细胞培养；4)上述单克隆细胞培养大约15天后消化细胞，提取基因组后进行PCR扩增后测序，筛选出GFP...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷峰，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33