本发明专利技术公开一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用，属于基因工程技术领域。所述方格星虫纤溶酶cDNA基因序列及其氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，其cDNA序列编码834个核苷酸，即277个氨基酸。通过pGAPZaA载体将方格星虫纤溶酶cDNA基因转入巴斯德毕赤酵母GS115菌株进行分泌表达，该重组纤溶酶具有直接溶解血栓中纤维蛋白的能力，可用于制备溶栓药物治疗血栓性疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及一种方格星虫纤溶酶cDNA基因以及方格星虫重组纤溶酶及其应用。
技术介绍
血栓栓塞性疾病是一种常见的心脑血管疾病，常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞等。随着人民生活水平的提高和人口老龄化的到来，心脑血管疾病已取代癌症成为我国第一大致死病因。目前临床应用溶栓药物降低血栓病患者的死亡率和致残率，但现有溶栓药还存在半衰期短、易出血及再栓塞等缺点。从生物中寻找溶栓药物的基因，开发新型的溶栓物质来治疗血栓性疾病是治疗心脑血管疾病的研究方向之一。方格星虫(Sipunculusnudus)俗称沙虫，隶属于星虫动物门、星虫纲、方格星虫属。方格星虫是我国星虫中种群数量较大的一个种，分布于我国东南沿海，广布于广西、广东、海南岛、福建和浙江，栖息于潮间带、高潮区的泥滩内，营底栖穴居生活。方格星虫主要供人食用，广西北海的“沙虫干”是当地有名的特产，其肉质鲜美，国内主要是对方格星虫的营养成分及增养殖方面进行研究。方格星虫以海洋中微藻和动植物碎片为食料，内脏存在有多种纤溶酶。目前，报道过方格星虫纤溶酶的相关专利有以下几篇：申请号：201010210919.5，方格星虫纤溶酶及其制备方法，该专利公开的是从方格星虫提取纤溶酶，分子量在27000～35000之间；申请号：201310142498.0，一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用，该专利公开的是从方格星虫中提取纤溶酶的分子量为24917Da；申请号：201310170384.7，海洋方格星虫纤溶酶及其制备和应用，该专利公开的从方格星虫消化腺体分离提取分子量15KDa的纤溶酶。上述公开的专利报道均是从自然界的方格星虫中提取纤溶酶，因此受到原料供应的限制，导致不能大批量生产，制备过程具有局限性。因此，急需一种通过基因工程的手段将溶血栓基因转入工程菌株中表达，研发出效果更好，副作用更低，更安全溶栓药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种方格星虫纤溶酶cDNA基因及重组纤溶酶；通过基因工程方法将纤溶酶基因转入基因工程菌株进行表达，能达到药物不受限制的进行制备生产。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：提供一种方格星虫纤溶酶cDNA基因，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，及具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。通过酵母蛋白表达系统所述方格星虫纤溶酶基因进行重组蛋白诱导表达，得到方格星虫重组纤溶酶，具体制备过程如下：(1)方格星虫纤溶酶cDNA序列的克隆：根据丝氨酸胰蛋白酶家族高度保守序列设计兼并引物，以海南儋州沿海方格星虫(S.nudus)消化道mRNA为模板，利用3’RACE和5’RACE技术扩增出方格星虫纤溶酶cDNA序列全长，连接TA克隆载体，转化E.coliDH5a感受态细胞。(2)毕赤酵母细胞转化表达构建酵母细胞pGAPZaA表达载体，选用EcoRI，Xbal内切酶酶切位点连接方格星虫纤溶酶cDNA基因，T4连接酶连接基因与载体，内切酶AvrII将载体线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞进行分泌表达。(3)方格星虫重组纤溶酶纯化与酶活用Ni柱纯化方格星虫重组纤溶酶，纤维蛋白平板检测重组纤溶酶酶活，与尿激酶相比，方格星虫重组纤溶酶酶比活力为75083IU/mg蛋白。SDS-PAGE检测分子量在29-44kDa之间。所述方格星虫重组纤溶酶用于血栓性疾病治疗以及制备溶栓药物。本专利技术根据NCBI上报道的多种纤溶酶基因保守位点设计兼并引物，从方格星虫内脏mRNA中扩增出部分纤溶酶cDNA基因，利用5’RACE和3’RACE技术获得该基因全长，并将该cDNA基因在毕赤酵母中获得表达，获得具有溶栓活性的重组方格星虫纤溶酶，可作为新型基因工程药物。附图说明图1是本专利技术中方格星虫纤溶酶cDNA基因PCR琼脂糖凝胶电泳图。图2是本专利技术中方格星虫重组纤溶酶在纤维平板法上纤溶活性示意图。图3是本专利技术中方格星虫重组纤溶酶在热处理纤维平板法上纤溶活性示意图。A为85℃热处理30min灭活纤维蛋白酶原的平板，B为未热处理平板。图4是本专利技术中方格星虫重组纤溶酶SDS-PAGE图。具体实施方式实施例一方格星虫纤溶酶全长cDNA基因的克隆实验材料：方格星虫，来自海南儋州海边；试剂：Trizol试剂(Invtrogen)，RACE5’/3’Kit，T-VectorpMD19，MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0，MiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0，PremixTaqTM，E.coliDH5aCompetentCells，DL2000Marker(TAKARA)，引物合成及基因测序(生工生物工程有限公司，深圳华大基因科技服务有限公司)。具体的实施方法如下：(1)方格星虫纤溶酶基因中间保守片段核苷酸序列的获得通过NCBI查找丝氨酸胰蛋白酶家族纤溶酶基因，查找保守序列设计兼并引物。上游引物ER：'5’-aacagggtcctgtgcgcngcncaytg3’，(简并度为32，Tm＝60.9)下游引物BF：'5’-gggccgccggagtcnccrttrca3’，(简并度为16，Tm＝62.5)方格星虫纤溶酶第一条链cDNA合成：方格星虫放入海水中暂养24h，排尽消化道泥沙，解剖虫体取黄色肠道组织用灭菌滤纸吸去溶液，液氮研磨成粉状，TRIzol法提取总RNA，-70℃冰箱保存。用RACE5’/3’Kit进行反转录实验，冰浴中加入5ul总RNA，1ul5’/3’CDSPrimerA，4ul5×First-StandBuffer，0.5uLDTT(100mM)，1.0uldNTPs(20mM)，0.5ulRNaseInhibitior(40u/ul)，2.0ulSMARTScribeReverseTranscriptase(100U)，用ddH2O补至20ul，混匀，短暂离心后将PCR管置于PCR仪中，42℃孵育90min，70℃10min，10uLTE稀释，获得5’/3’cDNA第一链，-20℃保存。克隆方格星虫纤溶酶基因：冰浴中加入12.5ul2×PremixTaqTM，引物ER、BF各1ul，1ul3’RACEcDNA第一链产物，ddH2O10ul混匀，按以下程序进行反应：预变性，94℃，3min，(变性94℃，30S，退火55℃-45℃，30S，延伸72℃，30S)20个循环，延伸72℃，7min，4℃终止反应，PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳。采用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0进行PCR产物凝胶回收。重组克隆载体转化：取感受态细胞DH5a置于冰浴融化，分别向感受态细胞悬液中加入10ulpMD19T重组克隆载体和目的基因PCR产物，混匀，冰浴中静置30min，42℃热激90s，迅速转移至冰浴中静置2-3min，加入900ulSOC液体培养基，37℃，150rpm振荡培养45min，吸取菌液100ul到LB(Amp+)固体琼脂培养基平板上，涂板，倒置37℃培养12-16h。在长满菌落的平板上随机挑取10个单克隆，分别溶解到10ulddH2O中，吸取5ul稀释菌液至干净的200ulPC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种方格星虫纤溶酶cDNA基因，其特征在于：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种方格星虫纤溶酶cDNA基因，其特征在于：具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.一种方格星虫纤溶酶cDNA基因，其特征在于：具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。3.一种方格星虫重组纤溶酶，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：马伏宁，郭刚，谭琳，金志强，马蔚红，臧小平，郭素霞，殷晓敏，孙佩光，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院海口实验站，
类型：发明
国别省市：海南;46
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