本发明专利技术公开了一种脯氨酸特异性蛋白酶基因及其应用，该脯氨酸特异性蛋白酶基因具有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。将该脯氨酸特异性蛋白酶基因导入到黑曲霉中表达，其表达量比内源基因(SEQ ID NO.1)表达量显著提高。本发明专利技术的黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因经密码子优化后合成两段人工基因，分别构建的表达盒导入到黑曲霉中进行表达，能够显著提高其在黑曲霉中的表达量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及提高脯氨酸特异性蛋白酶在黑曲霉表达的两段核酸序列，具体涉及一种经密码子优化的脯氨酸特异性蛋白酶基因及其应用。
技术介绍
脯氨酸特异性蛋白酶是一种能特异性地水解肽链中脯氨酸羧基端肽键的蛋白酶，属于丝氨酸蛋白酶家族。其活性中心由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的催化三联体组成。由于其独特的水解特性，使得脯氨酸特异性蛋白酶被用于食品，酿造，烘焙等领域。如CN 101511211A公开了一种包含脯氨酸特异性蛋白酶的涂抹酱；CN 101490235A公开了酿造啤酒时加入脯氨酸特异性蛋白酶以降低或消除啤酒冷浑浊的方法；WO2005117595A1公开了烘焙面包时添加脯氨酸特异性蛋白酶以改善性质的方法。迄今为止，绝大部分的脯氨酸特异性蛋白酶都是从丝状真菌发现的，如专利CN 101294153B，CN 103602605A，CN 103589741A分别描述了来源于黑曲霉，米曲霉和烟曲霉的脯氨酸特异性蛋白酶。但是，上述专利中描述的表达宿主都是毕赤酵母，由于脯氨酸特异性蛋白酶主要用于食品等领域，而毕赤酵母在表达蛋白时，需要以甲醇为碳源进行诱导表达，具有潜在的安全隐患，因此使用毕赤酵母生产食品添加剂并不是优选的。丝状真菌作为细胞工厂生产有价值的产品(如酶)为人们熟知，其中尤以黑曲霉和米曲霉由于‘通常认为安全的’(Generally Recognized As Safe，GRAS)的特征而被广泛用于表达宿主，因此工业上更加青睐黑曲霉和米曲霉用于生产脯氨酸特异性蛋白酶。如专利CN 102046784B描述了利用黑曲霉表达来源于产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的脯氨酸特异性蛋白酶。在工业生产中，追求微生物最大化表达量蛋白质或酶的意义重大，可以显著降低生产成本，并减少能源消耗和环境污染。一般情况下，可以通过传统菌种诱变方法提高微生物表达量，也可以通过基因工程手段提高：如利用强启动子，多拷贝基因，合适的信号肽等；其中密码子优化也是提高表达量一种方法，如CN 101294153B，CN 103602605A，CN 103589741A分别描述了将黑曲霉，米曲霉和烟曲霉的脯氨酸特异性蛋白酶基因经密码子优化后，可以提高在毕赤酵母的表达水平。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种经密码子优化的脯氨酸特异性蛋白酶基因。本专利技术人发现对于黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因，经密码子优化后，构建的表达盒导入到黑曲霉中进行表达，能够显著提高其在黑曲霉中的表达量。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：高表达的黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因，具有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。编码野生型黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因密码子优化后核酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，他们编码相同的氨基酸序列，如SEQ ID NO.4所示。两段人工合成基因(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)，他们编码黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶，导入到黑曲霉中表达，其表达量比野生型基因(SEQ ID NO.1)表达量至少提高5％，优选提高10％，优选高20％，更优选高40％。包含所述黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因的表达盒、重组表达载体、重组菌、转基因细胞系。为了构建脯氨酸特异性蛋白酶表达盒，需要特定的启动子，终止子，及调控序列：如5’UTR，3’UTR等；上述元件的选择和连接方式可通过参考本领域公开技术获得。启动子可以是黑曲霉内源启动子：如黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子，α-葡萄糖苷酶启动子等；也可以是外源启动子：如米曲霉中性淀粉酶启动子，米根酶糖化酶启动子；也可以是启动子变体：如黑曲霉中性淀粉酶变体。变体是指在野生型序列基础上通过插入、缺失或突变等方式对野生型序列中的核酸进行改变后的序列。与启动子3’末端连接的可以是调控序列：如合适的前导序列(5’UTR)，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区，如米曲霉中性淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列；优选的终止子选自如下酶的基因的终止子：黑曲霉糖化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。任一段人工基因，在与启动子，终止子相连接后形成表达盒。通过常规方法导入到黑曲霉基因组中，可以随机插入到基因组中，也可以定点整合到某个或多个基因座上。可选的基因座有gla(糖化酶)，amya(中性淀粉酶)，amyb(中性淀粉酶)，aa(酸性淀粉酶),agda(α葡萄糖苷酶)，agdb(α葡萄糖苷酶)。所述表达盒优选地可以与一个或多个选择性标记连接，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦phosphinothricin)乙酰转移酶)、hyg(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉的amdS和hyg。所述表达盒优选地可以与一个或多个反向选择标记(负选择标记)连接。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶),hsvTK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)。所述的重组表达载体为将上述的黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因插入表达载体得到的。所述的重组菌为将上述的重组表达载体导入宿主菌如黑曲霉或米曲霉中得到的。上述的黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因在提高脯氨酸特异性蛋白酶表达量中的应用。上述的表达盒、重组表达载体、重组菌、转基因细胞系在提高脯氨酸特异性蛋白酶表达量中的应用。一种制备脯氨酸特异性蛋白酶的方法，将上述的转基因重组菌发酵培养得到脯氨酸特异性蛋白酶。本专利技术中将DNA片段导入到宿主菌如黑曲霉或米曲霉内的方法为本领域常规方法。本专利技术的有益效果：本专利技术人发现，对于黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因，经密码子优化后合成两段人工基因，分别构建的表达盒导入到黑曲霉中进行表达，能够显著提高其在黑曲霉中的表达量。附图说明图1 pHphtk质粒图谱图2 pGla-PepWT质粒图谱图3 pGla-PepOPT1质粒图谱图4 pGla-PepOPT2质粒图谱具体实施方式实施例1pHphtk质粒的构建该质粒包含以下3部分，由GenScript公司构建完成，质粒图谱见图1。(1)pUC57质粒XbaI-PciI双酶切后得到的2305bp片段；(2)hph基因表达盒，序列见SEQ ID NO.5；(3)HSV-tk表达盒，序列见SEQ ID NO.6。实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高表达的黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因，具有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种高表达的黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因，具有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。2.包含权利要求1所述黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因的表达盒、重组表达载体、重组菌、转基因细胞系。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于为将权利要求1所述的黑曲霉脯氨酸特异性蛋白酶基因插入表达载体得到的。4.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于为将所述的重组表达载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：白挨玺，张垠，卞芙蓉，王彩梅，孙艳，徐红，
申请(专利权)人：南京百斯杰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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