一种猪弓形虫病的特异性检测引物和检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及疾病检测试剂制备技术领域，公开了一种猪弓形虫病的特异性检测引物和检测试剂盒，是将致密颗粒蛋白14（GRA14）基因作为弓形虫病诊断的靶基因，设计并筛选出一种弓形虫病的特异性检测引物GRAF‑3和GRAR‑3，GRAF‑3和GRAR‑3的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；利用该引物检测弓形虫病，特异性强，灵敏度高，PCR的方法结果容易判定，利用该引物制成检测弓形虫病的试剂盒，可实现对弓形虫病的流行病学调查，隐形感染的检测和临床诊断，为弓形虫病的诊断和防治技术等进一步研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种猪弓形虫病的特异性检测引物和检测试剂盒
本专利技术涉及疾病检测试剂制备
，更具体地，涉及一种猪弓形虫病的特异性检测引物和检测试剂盒。
技术介绍
弓形虫病是由弓形虫感染人和各种动物所引起的危害十分严重的人兽共患寄生虫病，弓形虫病广泛分布于我国及世界各地，西方国家人体平均感染率高达30%左右，我国人体平均感染率达7.88%，全国约有1亿人感染，其动物感染率更高。弓形虫病不仅是人类最常见的感染性疾病之一，而且亦是免疫抑制及免疫缺陷人群的主要致死病因之一，它与优生优育也有着密切关系，孕妇感染后可能直接影响胎儿的发育，严重时可致胎儿畸型甚至死亡。因此，弓形虫病不仅严重危害我国人民的生命和健康，而且严重影响中华民族的素质。我国能自然感染弓形虫病的动物种类有猪、黄牛、水牛、马、山羊、绵羊、鹿、猫、犬、鸡、兔等近200种，其中以猪的感染率较高，危害最为严重，是人体弓形虫病的主要传染源。在我国人民的饮食结构中，猪是最主要的肉食品来源，其健康与否影响千家万户。目前在我国，猪弓形虫病的地方性暴发流行还时常发生，尤其是在集约化猪场还较严重，猪群发病率高，死亡率也高，而且弓形虫病所引起的母猪流产和死胎也普遍存在，而且猪弓形虫病还经常与其它传染病混合感染。随着我国养猪业的发展，种猪及肉猪流通渠道的畅通，更加速了猪弓形虫病的传播和流行，给养猪业造成严重经济损失，并严重威胁人体健康。据估计，美国每年大约有225,000新病例，50%的病例是通过食物感染的。在美国染病猪肉也已成为人感染弓形虫病的主要来源。对人和动物弓形虫病的准确诊断是有效防控弓形虫病的前提，为此国内外学者已作了多方面的探索，包括病原学、免疫学和分子生物学诊断方法。从病料中查出弓形虫的存在，是最可靠的诊断方法，可将病料作触片或组织切片进行染色检查，或将病料接种于易感动物分离虫体。染色镜检通常用Giemsa染色或Wright’s染色，但症状轻微或即将耐过的病猪，以及使用磺胺类药物治疗过的病猪，往往不易检出弓形虫。加之病料采集的局限性，也容易被漏检。弓形虫感染人和动物后可在体内释放循环抗原并诱导产生抗弓形虫抗体，可采用免疫学方法检测人和动物体内的弓形虫循环抗原及抗弓形虫抗体。可用于弓形虫病免疫诊断的方法有很多，包括各种凝集试验（例如间接血凝试验，IHA），间接荧光抗体试验（IFAT），酶联免疫吸附试验及其改进方法，胶体金免疫层析法等。但弓形虫病的免疫学检测方法仍存在很多问题，如交叉反应、检出率不高、假阳性较多、费时费力，又多受机体免疫状态的影响，容易出现误诊和漏诊，不能作为现症的诊断依据等。近年来，以聚合酶链反应（PCR）为基础的分子生物学方法已在寄生虫学领域得到广泛应用。PCR也以其简便、快速、特异、灵敏等优势在人及动物弓形虫病的诊断中应用，而建立弓形虫病特异PCR诊断方法的关键是寻找敏感、特异的遗传标记。然而，目前报道的B1基因（Pellouxetal，1998；Continietal，2002）、核糖体DNA内转录间隔区（ITS）序列（Jaureguietal，2001；谢德华等，2005）及从弓形虫基因组中鉴定出一个200-300个拷贝的529bp重复DNA片段（Homanetal，2000）等作为遗传标记而建立弓形虫病特异PCR诊断方法，从敏感性、特异性及临床应用方面未能明确在猪弓形虫病现诊感染的应用效果。致密颗粒蛋白（GRA）是弓形虫入侵宿主细胞后由致密颗粒释放入纳虫泡的一类分泌代谢抗原；GRA在人体和实验中具有较强的免疫反应性和免疫原性，因而在弓形虫病的诊断和免疫预防中具有潜在价值。免疫细胞化学证实在弓形虫多个生活史阶段如速殖子、缓殖子、裂殖体等阶段都有GRA14基因存在，可作为弓形虫病新型诊断标记建立敏感、特异的PCR诊断方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种猪弓形虫病的特异性检测引物。本专利技术的第二个目的是提供含有所述特异性检测引物的PCR反应液。本专利技术的第三个目的是提供含有所述PCR反应液的试剂盒。本专利技术的第四个目的是提供利用所述试剂盒检测猪弓形虫病的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种猪弓形虫病的特异性检测引物GRAF-3和GRAR-3，GRAF-3和GRAR-3的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。本专利技术将致密颗粒蛋白14（GRA14）基因作为弓形虫病诊断的靶基因，设计多对引物，最终筛选获得一对引物能够特异性检测弓形虫病。本专利技术还提供含有所述特异性检测引物GRAF-3和GRAR-3的PCR反应液。本专利技术还提供含有所述PCR反应液的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括样品DNA提取液和阳性对照品。优选地，所述样品DNA提取液包括相互独立包装的血液、精液DNA提取液和/或组织DNA提取液和/或水样、粪便DNA提取液。需要说明的是，上述血液、精液DNA提取液可以选用现有技术中常用的，可用于提取致密颗粒蛋白14（GRA14）基因的提取液，其提取液的具体组分不受限制。为了清楚的说明，这里血液、精液DNA提取液的组成可以是：红细胞裂解液（DDT）、BufferGA、BufferGB、BufferGD、BufferPW、BufferTE、酒精。更具体地，所述血液、精液DNA提取液的组成为：50个反应的250mL红细胞裂解液（10mLDDT）、15mLBufferGA、15mLBufferGB、13mLBufferGD、15mLBufferPW、15mLBufferTE、1mL蛋白酶K，10mL的96%～100%酒精。需要说明的是，上述组织DNA提取液可以选用现有技术中常用的，可用于提取致密颗粒蛋白14（GRA14）基因的提取液，其提取液的具体组分不受限制。为了清楚的说明，这里组织DNA提取液的组成可以是：核裂解液、0.5MEDTA、Wizard@SVLysisBuffer、柱清洗液、RNaseA溶液、无核酸酶水。更具体地，所述组织DNA提取液的组成为：50个反应的50mL核裂解液、30mL0.5MEDTA、50mLWizard@SVLysisBuffer、185mL柱清洗液、25mLRNaseA溶液、2×25mL无核酸酶水。需要说明的是，上述水样、粪便DNA提取液可以选用现有技术中常用的，可用于提取致密颗粒蛋白14（GRA14）基因的提取液，其提取液的具体组分不受限制。为了清楚的说明，这里水样、粪便DNA提取液的组成可以是：ASLBuffer、蛋白酶K、BufferAL、BufferAW1、BufferAW2、BufferAE、酒精。更具体地，所述水样、粪便DNA提取液的组成为：50个反应的140mL的ASLBuffer、1.4mL的蛋白酶K、33mL的BufferAL、19mL的BufferAW1、13mL的BufferAW2、12mL的BufferAE、10mL的96%～100%酒精。优选地，所述PCR反应液中GRAF-3和GRAR-3的浓度分别为50pmol/μL。更优选地，所述PCR反应液的组成为：40个反应的500μlPremixE×TaqVersion2.0（LoadingdyeMix）、终浓度分别为50pmol/μL的弓形虫GRA14特异性引物（引物GRAF-3和G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪弓形虫病的特异性检测引物GRAF‑3和GRAR‑3，其特征在于，GRAF‑3和GRAR‑3的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种猪弓形虫病的特异性检测引物GRAF-3和GRAR-3，其特征在于，GRAF-3和GRAR-3的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。2.含有权利要求1所述特异性检测引物GRAF-3和GRAR-3的PCR反应液。3.含有权利要求2所述PCR反应液的试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品DNA提取液和阳性对照品。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述样品DNA提取液包括相互独立包装的血液、精液DNA提取液和/或组织DNA提取液和/或水样、粪便DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：林瑞庆，何茜，翁亚彪，吕梦娜，黎盛琴，唐陶，张小刚，胡伟高，周志东，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44