适于酵母中的异源基因表达的启动子制造技术

本发明专利技术涉及新的启动子用于异源基因表达的用途，优选为用于耶氏酵母属(genus Yarrowia)的生物中基因表达的用途，涉及经遗传修饰的耶氏酵母属生物，并涉及用于通过培养所述经遗传修饰的生物来生产生物合成产物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求申请日为2014年1月31日的美国临时专利申请No.61/933,979的申请日权益，其公开内容通过提述在此并入本文。专利
本专利技术涉及新的启动子用于异源基因表达的用途，优选为用于耶氏酵母属(genusYarrowia)的生物中基因表达的用途，涉及经遗传修饰的耶氏酵母属生物，并涉及用于通过培养所述经遗传修饰的生物来生产生物合成产物的方法。专利技术背景细胞中天然代谢过程产生多种生物合成产物，例如精细化学品，例如尤其是氨基酸、维生素、类胡萝卜素，其用于多种工业分支中，包括人与动物食品、化妆品、以及制药工业。其大规模生产是部分通过生物技术方法用微生物来进行的，所述微生物经过开发以产生和分泌大量具体所需的物质。例如，类胡萝卜素是在细菌、藻类和真菌中从头合成的。近年来，越来越多地尝试利用油质(oleaginous)酵母和真菌作为生产精细化学品，尤其是生产维生素和类胡萝卜素的生物。类胡萝卜素(如叶黄素、玉米黄素、虾青素和β胡萝卜素)作为所谓的油性树脂提取自例如耶氏酵母属。这些油性树脂既用作膳食补充剂的成分，也用于饲料行业(sector)中。酮式类胡萝卜素(ketocarotenoids)，意即包含至少一个酮基的类胡萝卜素，例如虾青素、角黄素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3’-羟基海胆酮、金盏花红素(adonirubin)和金盏花黄素(adonixanthin)，是天然抗氧化剂和色素，其由一些藻类、生物和微生物作为次级代谢物产生。这些分子在能生产其的生物(如酵母和细菌)中的生物合成已得到了详细表征(Weinheim等,(1996)Ullmann'sEncyclopediaofIndustrialChemistry,\Vitamins\,Vol.A27,pp.443-613；BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Michal,G.Ed.(1999)；Ong,A.S.,Niki,E.和Packer,L.,(1995)\Nutrition,Lipids,HealthandDisease\ProceedingsoftheUNESCO/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysiaandtheSocietyforRreeRadicalResearch-Asia，举办于1994年9月1-3日，于Penang,Malaysia,AOCSPress,Champaign,ILX,374S)。具体而言，类胡萝卜素在耶氏酵母中的生物合成描述于WO2006/102342中。由于酮式类胡萝卜素的着色特性，将其与特别是虾青素用作家畜营养中(尤其是在鳟鱼、鲑鱼和虾的养殖中)的着色剂。因此，用于生产天然生物合成产物(并且尤其是类胡萝卜素)的经济的生物技术方法是非常重要的。WO2008/042338公开了多个用于在耶氏酵母中过表达类胡萝卜素生物合成基因的启动子。EP0220864A中公开了一种的启动子。该文献描述了解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)启动子XPR2。该XPR2酵母启动子在缺乏偏好的碳和氮源的培养基上仅在pH6.0以上有活性，并且完全诱导需要在培养基中高水平的蛋白胨(Ogrydziak,D.M.,Demain,A.L.,和Tannenbaum,S.R.,(1977)Biochim.Biophys.Acta.497:525-538.；Ogrydziak,D.M.和Scharf,S.J.,(1982)Gen.Microbiol.128:1225-1234.)。用于在酵母(例如耶氏酵母)中表达基因的另一种启动子，描述于WO1997/044470中。然而，迄今为止使用的启动子无法完全满足在耶氏酵母中进行高表达的需求。因此需要提供更好地满足这些需求的启动子。因此，本专利技术的目的是提供新的改进的酵母启动子，尤其用于在酵母中克隆表达，而且用于在选择的表达系统中异源表达上述合意的精细化学品。专利技术概述本专利技术涉及一种重组核酸分子，其包含：a)与SEQIDNO:1(在此称为HSP)或SEQIDNO:2(在此称为HYP)的多核苷酸序列具有至少90％同一性的多核苷酸序列，或b)在严格条件下与核酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2杂交的核酸序列，或c)a)或b)的序列的功能上等同的片段。在一个方面，本专利技术涉及一种重组核酸分子，其包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。在本专利技术的一个具体方面，所述重组核酸分子作为启动子发挥功能。所述重组核酸分子用于在酵母中调控基因的表达。在一个实施方案中，所述酵母是耶氏酵母属的生物。在一个实施方案中，所述酵母是解脂耶氏酵母的菌株。在另一个实施方案中，所述被调控的基因对于耶氏酵母属的生物体是异源的。在一个实施方案中，所述重组核酸分子与编码蛋白的基因是功能上相连的(functionallylinked)。在一个实施方案中，所述基因与一个或多个其他调控信号是功能上相连的。在一个具体实施方案中，所述功能上相连的基因选自编码蛋白的核酸的组，所述蛋白来自：a)有机酸的生物合成途径，或b)脂质和脂肪酸的生物合成途径，或c)二醇的生物合成途径，或d)芳香族化合物的生物合成途径，或e)维生素的生物合成途径，或f)类胡萝卜素，特别是酮式类胡萝卜素的生物合成途径。在一个实施方案中，本专利技术所述的重组核酸分子是载体。本专利技术还涉及经遗传修饰的微生物，其包含上述的重组核酸分子。在一个实施方案中，所述微生物是耶氏酵母属的成员。在另一个实施方案中，上述的重组核酸分子用于在宿主微生物中表达一个或多个基因，其中至少一个或多个基因的表达速率(expressionrate)与野生型相比是提高的。在一个具体实施方案中，所述基因在宿主微生物中的表达调控通过如下实现：a)将一个或多个上述重组核酸分子引入宿主微生物的基因组中，从而使宿主微生物一个或多个内源基因的表达在引入的重组核酸分子控制下发生；b)将一个或多个基因引入所述微生物的基因组中，从而使所述一个或多个引入的基因的表达在上述重组核酸分子控制下发生，所述重组核酸分子对于宿主微生物是内源的；或c)将一个或多个核酸构建体引入宿主微生物中，其中所述一个或多个核酸构建体包含至少一个上述重组核酸分子，且所述重组核酸分子与一个或多个要表达的基因是功能上相连的。本专利技术还涉及生产生物合成产物的方法，包括如下步骤：a)在培养基中培养耶氏酵母属的经遗传修饰的微生物，其中所述经遗传修饰的微生物包含上述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子与编码蛋白的基因是功能上相连的；及b)生产步骤a)中制成的生物合成产物。在一些实施方案中，所述生物合成产物分泌至培养基中。在一些实施方案中，所述生物合成产物在微生物中积累。在一些实施方案中，将所述生物合成产物从分离的微生物生物质回收。在一些实施方案中，所述生物合成产物是类胡萝卜素。附图简述图1和图2分别显示了摇瓶实验中测试的两个启动子的平均玉米黄素和虾青素水平本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组核酸分子，其包含：a)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少90％同一性的多核苷酸序列，或b)在严格条件下与核酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2杂交的核酸序列，或c)a)或b)的序列的功能上等同的片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.31 US 61/933,9791.一种重组核酸分子，其包含：a)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的多核苷酸序列具有至少90％同一性的多核苷酸序列，或b)在严格条件下与核酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2杂交的核酸序列，或c)a)或b)的序列的功能上等同的片段。2.权利要求1的重组核酸分子，其中所述多核苷酸序列与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性。3.权利要求1或2的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子作为启动子发挥功能。4.权利要求1或2的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子用于在酵母中调控基因的表达。5.权利要求4的重组核酸分子，其中所述酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)菌株。6.权利要求5的重组核酸分子，其中所述基因对于耶氏酵母属(genusYarrowia)的生物体是异源性的。7.前述任一项权利要求的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子与编码蛋白的基因是功能上相连的。8.权利要求7的重组核酸分子，其中所述基因选自编码蛋白的核酸的组，所述蛋白来自：a)有机酸的生物合成途径，b)脂质和脂肪酸的生物合成途径，c)二醇的生物合成途径，d)芳香族化合物的生物合成途径，e)维生素的生物合成途径，或f)类胡萝卜素，特别是酮式类胡萝卜素(ket...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·L·麦格拉斯，B·谢弗勒，P·S·约尔杰，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL