构建在海马体区域特异性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法及打靶载体和试剂盒技术

本发明专利技术公开了构建在海马体区域特异性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法及打靶载体和试剂盒。本发明专利技术利用Cre‑LoxP重组系统构建在特定小鼠组织中敲除IKKα基因，从而建立IKKα基因敲除的转基因小鼠，以便在动物的整体水平研究NF‑κB信号通路与疾病尤其是肿瘤的作用机制。同时，为便于确定和监测IKKα基因在海马体区域的特异性敲除是否会对小鼠行为学造成影响，在本发明专利技术中利用红色荧光素酶RFP720连接至转基因载体中。即，本发明专利技术通过基因打靶技术，基于iRFP720近红外荧光蛋白和Cre‑LoxP基因敲除系统降低小鼠海马体区域内源性IKKα基因的表达，进而通过动物成像系统监测转基因小鼠的活体成像。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于影像学、病理学、生理学，遗传学，分子生物学以及行为学
具体涉及构建在海马体区域特异性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法及打靶载体和试剂盒。
技术介绍
IKKα是组成IKK复合物的调节亚基，IKK复合物能够影响NF-κB信号通路的活化。在胶质瘤(一种发生在脑部的肿瘤)研究中表明，NF-κB等与炎症相关的信号通路处于异常活化状态，目前关于IKKα在脑部肿瘤中的机制研究并不清楚，其敲除后是否会影响脑部肿瘤的发生发展尚不明确，同时其作为炎症相关分子，在正常哺乳动物海马体区域完全敲除后是否会影响其行为学功能并不清楚。因此，利用动物模型研究脑部IKKα异常活化而引发的疾病，可以为人类脑部肿瘤及可能伴随的异常行为学功能的诊断，治疗提供理论基础。IKK复合物主要有三种亚基组成，分子量大小为700-900KD，三种亚基分别为IKKα(85KD)，IKKβ(87KD)，IKKγ(48KD)，其中IKKα和IKKβ为催化亚基，IKKγ为结构亚基。IKKα和IKKβ的基因结构相似，但具有不同的生物学活性。IKKα蛋白可与TNFα受体家族成员中的NF-κB受体激活蛋白作用，进而影响NF-κB蛋白与DNA的结合活性。而IKKβ蛋白主要与炎症相关。IKK复合物的活化主要与能引起IKK复合物磷酸化修饰的生物学进程相关。在肿瘤的发生发展过程中，NF-κB的抗凋亡，促增殖和免疫激活功能是致使正常细胞癌变的重要因素。在胶质瘤细胞中，NF-κB处于异常活化和持续激活状态。正常细胞中，NF-κB参与的炎症反应对于维持机体正常防御外界因素感染以及修复机制有重要作用。完全敲除IKKα基因，会导致小鼠胚胎致死。Cre-LoxP系统是由一个单一的Cre重组酶和被称为LoxP序列的靶向基因敲除序列组成。Cre重组酶有70％的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。它是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点(序列)之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。Cre-Lox重组系统在目前存在的转基因动物模型的表型和基因型之间的联系实现最佳的实验控制Cre重组酶可以识别LoxP序列，通过DNA重组的原理，可以将两个LoxP序列之间的片断，即DNA片断去除。如果是没有Cre，LoxP只是在特定的基因片段两侧，不影响基因片段的活性。一旦Cre酶有活性，就可以把LoxP中间所夹的序列去除，即条件性基因敲除。Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。目前，国内、外实验动物成像的主要手段包括结构成像(解剖成像)及功能成像(分子成像)。活体光学成像与micro-CT、MRI(magneticresonanceimaging)、ultrasound等结构成像手段结合，能为动物实验提供更客观的数据、更确切的分子生物特性。活体成像技术可以从影响基因表达的各个不同的层面进行基因研究，可应用于某种疾病的基因表达、转基因动物实验以及基因治疗等，可将靶基因进行荧光素酶标记后转入动物体内，形成研究所需的各种小动物疾病模型，包括肿瘤，免疫系统疾病，感染性疾病等。近红外光的最大吸收波长和发射波长为650-900nm，活体成像时，哺乳动物组织因其透光性和深度组织的背景干扰，普通的荧光标签不能很好的反应其生理功能，近红外荧光是近年来在影像学研究中较为热门的研究之一，因其可减少自发荧光和低光散射使其可作为穿透深度组织的优选标签。iRFP720是一种近红外荧光蛋白基因，从细菌的感光细胞中分离得到，可用于基因工程编辑构建打靶载体的标签，目前对于iRFP720作为一种近红外红色荧光标签构建动物模型的研究较为缺乏。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供构建在海马体区域特异性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法及打靶载体和试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述构建在海马体区域特异性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法包括如下步骤：(1)构建打靶载体pBR322-MCS-2S-Chuk-KI，所述打靶载体pBR322-MCS-2S-Chuk-KI的序列如SEQIDNO.1所示；(2)将iRFP720红色荧光蛋白基因连接至打靶载体，然后导入小鼠，构建携带有iRFP720基因的IKKα基因knockin杂合型小鼠；(3)将IKKα基因knockin杂合型转基因小鼠与CamKIIalpha-creT29-1转基因小鼠分别与C57野生型小鼠扩大繁殖，然后将IKKα基因knockin杂合型转基因小鼠与CamKIIalpha-creT29-1转基因小鼠交配获得杂合IKKαF/+·Camk2α.Cre-LoxP小鼠，再利用杂合型小鼠自交获得纯合型IKKαF/F·Camk2α.Cre-LoxP小鼠；通过小动物活体成像仪分别观察杂合型及纯合型Cre-LoxP小鼠的红色荧光，选择可以检测到iRFP720红色荧光蛋白表达的小鼠，即为在海马体区域特异性敲除IKKα基因的小鼠模型。构建打靶载体pBR322-MCS-2S-Chuk-KI的试剂盒中包括如下引物：Chuk-A-F：ACGCGTCGACGAACACTTTTCTAAGGCTG(SEQIDNO.2)；ChukA-R：CGGGGTACCCACTTCCTTTTGAAATTAG(SEQIDNO.3)；Chuk-B-F：CGGGGTACCTATTTTAGACCGTCAGTC(SEQIDNO.4)；Chuk-B-R：CGCGGATCCTTGGCCAAGCCATGGCG(SEQIDNO.5)；RFP720-F：AATATGGCCACACGGTCGCCACCATGGCG(SEQIDNO.6)；RFP720-R：AGGGAATCTACACAGTCGCGGCCGCTCACTC(SEQIDNO.7)；En2SA-F：GACTGTGGCCATATTATCATCG(SEQIDNO.8)；BGH-R：CTGTGTAGATTCCCTGGGACC(SEQIDNO.9)。下面对本专利技术作进一步说明：本专利技术的详细步骤如下：(一)打靶载体的构建从Ensembl数据库中(http://www.ensembl.org/index.html)获得Chuk基因组序列，根据基因组序列设计打靶载体。小鼠Chuk-001转录本共有21个外显子，根据生物信息学分析，knockin元件、neo、frt等元件插入第1～2内含子。运用ET克隆的方法构建Chuk基因1～2内含子插入knockin元件的打靶载体。大致过程如下：以BAC质粒为模板DNA，PCR扩增A、B、C、D四个小同源臂。A臂和B臂克隆至pBR322-2S的SalI、BamHI的位点，该质粒经KpnI单酶切后，获得retrieve质粒；通过同源重组方式，经氨苄青霉素筛选，获得克隆了BAC的A区域到B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建在海马体区域特异性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建打靶载体pBR322‑MCS‑2S‑Chuk‑KI，所述打靶载体pBR322‑MCS‑2S‑Chuk‑KI的序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将iRFP720红色荧光蛋白基因连接至打靶载体，然后导入小鼠，构建携带有iRFP720基因的IKKα基因knock in杂合型小鼠；(3)将IKKα基因knock in杂合型转基因小鼠与CamKIIalpha‑cre T29‑1转基因小鼠分别与C57野生型小鼠扩大繁殖，然后将IKKα基因knock in杂合型转基因小鼠与CamKIIalpha‑cre T29‑1转基因小鼠交配获得杂合IKKαF/+.Camk2α.Cre‑LoxP小鼠，再利用杂合型小鼠自交获得纯合型IKKαF/F.Camk2α.Cre‑LoxP小鼠；通过小动物活体成像仪分别观察杂合型及纯合型Cre‑LoxP小鼠的红色荧光，选择可以检测到iRFP720红色荧光蛋白表达的小鼠，即为在海马体区域特异性敲除IKKα基因的小鼠模型。

【技术特征摘要】
1.一种构建在海马体区域特异性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建打靶载体pBR322-MCS-2S-Chuk-KI，所述打靶载体pBR322-MCS-2S-Chuk-KI的序列如SEQIDNO.1所示；(2)将iRFP720红色荧光蛋白基因连接至打靶载体，然后导入小鼠，构建携带有iRFP720基因的IKKα基因knockin杂合型小鼠；(3)将IKKα基因knockin杂合型转基因小鼠与CamKIIalpha-creT29-1转基因小鼠分别与C57野生型小鼠扩大繁殖，然后将IKKα基因knockin杂合型转基因小鼠与CamKIIalpha-creT29-1转基因小鼠交配获得杂合IKKαF/+.Camk2α.Cre-LoxP小鼠，再利用杂合型小鼠自交获得纯合型IKKαF/F.Camk2α.Cre-LoxP小鼠；通过小动物活体成像仪分别观察杂合型及纯合型Cre-LoxP小鼠的红色荧光，选择可以检测到iRFP720...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶永光，赖巍巍，刘双，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43