本发明专利技术公开了一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用。本发明专利技术针对鸡白痢沙门氏菌的特异性片段，设计了一种用于特异性扩增鸡白痢沙门氏菌的引物，并建立了一种能够直接从粪便样品中检测鸡白痢沙门氏菌的PCR检测方法，该方法特异性好、灵敏度高、检测时间短，可以从鸡粪便样品中快速准确的检测出鸡白痢沙门氏菌，而对于19种其他常见致病性沙门氏菌血清型和7种常见非沙门氏菌致病菌的扩增结果均为阴性。因此，本发明专利技术的提出为鸡白痢沙门氏菌的检测提供了一种快速、有效的技术手段，而且该方法操作简单、对设备的要求低，整个检测过程只需一天就可以完成，能够满足大部分家禽养殖厂对鸡白痢沙门氏菌快速检测的需求。
【技术实现步骤摘要】
用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物以及含有该引物的试剂盒，还涉及使用所述的引物以及试剂盒快速检测鸡白痢沙门氏菌的特异性PCR方法，本专利技术属于生物技术检测领域，
技术介绍
沙门氏菌(Salmonella)是主要的食源性致病菌之一，其血清型众多，目前已经确定的血清型有2600多种，但只有某些特定的沙门氏菌血清型会感染人和动物。其中，鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)是严重影响我国禽养殖业发展的宿主特异性病原菌，其传播范围广，致病性强，主要感染21日龄以内的雏鸡，可以引起白色下痢，并且雏鸡感染后死亡率几乎100％；然而成年鸡感染鸡白痢沙门氏菌后通常没有临床症状，但作为病原携带者，不仅可以水平传播，而且可以垂直传播。因此，鸡白痢沙门氏菌是一种传播快、危害大的致病性病原菌。及时准确地检测出鸡白痢沙门氏菌，做出相应的防控措施显得尤为重要。传统的沙门氏菌血清学检测仍然是通过细菌与特异性抗体的凝集反应鉴别其O抗原和H抗原，根据White-Kauffmann-LeMinor抗原表确定沙门氏菌的血清型。但该方法对某些血清型的鉴别容易混淆，甚至无法鉴别，如鸡白痢、鸡伤寒和肠炎三种沙门氏菌血清型的抗原结构相似，鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌没有运动性，H抗原检测结果为阴性，肠炎沙门氏菌H抗原容易发生变异，必须通过常规的生化鉴定才可以进一步确定这三种沙门氏菌血清型，这种常规的检测方法需要5至7天的时间，过程繁琐，耗时耗力。PCR作为病原检测的一种方法表现出巨大的潜力，它在检测病原菌时具有快速、灵敏、特异等优点。在我国，鸡白痢已经是我国家禽最主要的细菌病之一，并且被国家列为规定净化的细菌病，对鸡白痢沙门氏菌进行快速、准确的检测是净化和防治鸡白痢的关键。
技术实现思路
针对鸡白痢沙门氏菌在检测过程中容易出现的问题，本专利技术的目的在于提供一种快速地、特异性地检测鸡白痢沙门氏菌的引物及其检测方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下的技术方案：一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物，由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。进一步的，本专利技术还提出了含有所述的特异性引物的PCR检测试剂盒。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，还含有PCR扩增缓冲液、阳性对照以及阴性对照。其中，优选的，所述的阳性对照为鸡白痢沙门氏菌菌株的基因组DNA或是含有SEQIDNO.1所示序列的载体；所述的阴性对照为无菌水。再进一步的，本专利技术还提出了使用所述试剂盒检测鸡白痢沙门氏菌的方法，其包括以下步骤：步骤一，提取待检样品基因组DNA，使用所述的试剂盒进行PCR扩增；步骤二，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸡白痢沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果在356bp位置出现单一的扩增条带，则说明样品中含有鸡白痢沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有鸡白痢沙门氏菌。其中，优选的，步骤一中所述PCR扩增所采用的检测体系为25μL反应体系包括：2×PremixExTaq12.5μL，10μM的上下游引物各0.5μL，模板溶液1μL，最后灭菌去离子水补足至25μL。其中，优选的，步骤一中所述PCR扩增所采用的扩增程序为：先94℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环共30个；循环结束后，72℃延伸7min，降温至10℃，结束。更进一步的，本专利技术还提出了所述的引物或所述的试剂盒在制备检测鸡白痢沙门氏菌试剂中的应用。优选的，所述的试剂用于区别鸡白痢沙门氏菌以及其他致病性沙门氏菌血清型。其中，优选的，所述的其他致病性沙门氏菌血清型包括鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型。与现有检测技术相比较，本专利技术的有益效果在于：采用本专利技术的检测方法相比于其他检测方法具有明显优势。例如常规的细菌分离鉴定费时费力；平板凝集实验虽然快速简便，但容易出现假阳性，导致误淘，引起不必要的经济损失；免疫荧光、酶联免疫吸附等免疫学检测方法虽然比较准确，但由于这些方法的抗体制备困难，也不易于推广。但本专利技术建立的鸡白痢沙门氏菌PCR检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确，能够有效防止对鸡只的误淘汰；而且该方法操作简单、快速，在普通的分子实验室均可以进行，整个检测过程只需一天就可以完成，在我国提倡净化养殖场鸡白痢沙门氏菌的背景下，本专利技术具有重要意义。附图说明图1为本专利技术实施例1中鸡白痢沙门氏菌SEEP17495基因特异性检测结果；其中，图A中，M：DL2000DNAMarker，1：鸡白痢沙门氏菌527，2：鸡白痢沙门氏菌528，3：大肠杆菌CVCC1555，4：大肠杆菌CVCC1560，5：单增李斯特菌，6：奇异变形杆菌，7：金黄色葡萄球菌，8：鲍曼不动杆菌，9：粘质沙雷氏菌，N：阴性对照。图B、C中，M：DL2000DNAMarker，1-31：分别对应表1中序号各菌株，N：阴性对照。图2为本专利技术施例2中鸡白痢沙门氏菌灵敏度评价试验检测结果；其中，M：DL2000DNAMarker；1-7：分别对应浓度106cfu/mL-100cfu/mL，N：阴性对照。图3为本专利技术施例3中鸡白痢沙门氏菌的鸡粪模拟样品检测灵敏度的试验结果；其中，M：DL2000DNAMarker；1-7：分别对应浓度106cfu/mL-100cfu/mL，N：阴性对照。具体实施方式下面通过实验并结合实施例对本专利技术做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1引物设计对GenBank中鸡白痢、鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型全基因组进行全面的生物信息学分析，最终确定SEEP17495基因(SEQIDNO.1所示)为鸡白痢沙门氏菌的检测靶基因。根据SEEP17495基因，使用Oligo6软件设计特异性引物，引物由苏州金唯智公司合成。引物序列如下：SEEP17495-idF：5’CGATAATGGCAACCGCACTG3’(SEQIDNO.2所示)；SEEP17495-idR：5’TGATGTCTGCCCCTTTCGAC3’(SEQIDNO.3所示)。实施例2：鸡白痢沙门氏菌血清型PCR检测方法的建立1、实验用菌株与试剂实验菌株见表1，其中11株分离株为哈尔滨兽医研究所动物细菌病实验室分离鉴定。PremixExTaqDNA聚合酶和MarkerDL2000购自TaKaRa公司。表1实验菌株注：a：中国兽医微生物菌种保藏管理中心；b：中国医学细菌保藏管理中心；c：中国工业微生物菌种保藏管理中心；d：美国典型培养物保藏中心；e：本室保存2、方法步骤一，DNA模板制备将表1所列菌株分别接种于5mLLB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将1mL过夜培养的菌液加入1.5mLEppendorf离心管中，5000rpm离心5min，弃去本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物，其特征在于所述引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物，其特征在于所述引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.含有权利要求1所述的特异性引物的PCR检测试剂盒。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还含有PCR扩增缓冲液、阳性对照以及阴性对照。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性对照为鸡白痢沙门氏菌菌株的基因组DNA或是含有SEQIDNO.1所示序列的载体；所述的阴性对照为无菌水。5.如权利要求2-4任一项所述的试剂盒，其特征在于用于检测鸡白痢沙门氏菌时包括以下步骤：步骤一，提取待检样品基因组DNA，使用权利要求2-4任一项所述的试剂盒进行PCR扩增；步骤二，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸡白痢沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果在356bp位置出现单一的扩增条带，则说明样品中含有鸡白痢沙门氏菌；如果没有...
【专利技术属性】
技术研发人员：于申业，刘思国，曹俊，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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