一种检测路氏锥虫的引物对和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测路氏锥虫的引物对和试剂盒，即通过比对路氏锥虫和其他锥虫的大环序列，筛选出一对能够特异性检测路氏锥虫的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；该引物对能特异性扩增出路氏锥虫的部分片段，且灵敏度高，能够检测出仅仅含有10个锥虫的样本，或者是10ng的DNA样本；利用该引物对能够快速准确的将其从其他锥虫亚属中，以及利什曼原虫（

【技术实现步骤摘要】
一种检测路氏锥虫的引物对和试剂盒
本专利技术涉及寄生虫分子检测
，更具体地，涉及一种检测路氏锥虫的引物对和试剂盒。
技术介绍
在自然界中，路氏锥虫（Trypanosomalewisi）是一种呈全球性分布的寄生原虫，借助媒介昆虫跳蚤在哺乳动物间传播。长期被认为具有严格宿主特异性的寄生原虫，专性寄生屋顶鼠（RattusRattus）、褐家鼠（Rattusnorvegicus）等。近年来国外有多例路氏锥虫感染人的报道，且具备抵抗人血清溶解的能力，揭示该寄生原虫是一种长期被忽视的重要人兽共患病原体。我国东北地区也检出了1%阳性率。虽然已知该原虫的广泛分布性，由于公众的忽视，流行病学的数据已经过时，现阶段有必要对其进行流行病学调查以评估感染人的风险。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述问题，提供一种检测路氏锥虫的引物。本专利技术的第二个目的是提供含有所述引物的试剂盒。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种检测路氏锥虫的引物对TL3-F和TL3-R，所述引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。本专利技术将路氏锥虫和其他类似锥虫的基因进行比对，并经过引物设计，筛选出一对能够特异性检测路氏锥虫的引物对。因此，本专利技术还提供含有所述引物对的试剂盒。优选地，所述试剂盒还含有PCR扩增反应试剂；这里所说的PCR扩增反应试剂是指能够使得样本DNA在上述引物对的作用下进行PCR扩增反应的试剂，现有技术中常规PCR扩增反应试剂均可用于本专利技术。所述PCR扩增反应试剂可用商品化的试剂，例如PrimerSTARMaxPremix。优选地，若为DNA样本，所述试剂盒的PCR扩增反应体系为：12.5μl的PCR反应试剂，引物TL3-F和引物TL3-R、100ng样本DNA，灭菌双蒸水补齐至25μl，引物TL3-F和引物TL3-R在反应体系中的终浓度分别为6.25pmol/L。优选地，若为血液样本，所述试剂盒的PCR扩增反应体系为：12.5μl的PCR反应试剂，引物TL3-F和引物TL3-R、10μl样本血液溶解液，灭菌双蒸水补齐至25μl，引物TL3-F和引物TL3-R在反应体系中的终浓度分别为6.25pmol/L。优选地，所述试剂盒的PCR扩增反应条件为：30个反应循环：98℃变性10s，54℃退火15s，72℃延伸8s。利用该试剂盒进行PCR检测路氏锥虫的方法为：（1）提取样本DNA或者样本血液；（2）在样本DNA或者样本血液中加入PCR扩增反应试剂进行PCR扩增，进行结果判定：若扩增出一条1602bp大小的条带，则被检测样本中含有路氏锥虫，反之则被检测样本中没有路氏锥虫。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术是利用kDNA（kinetoplastDNA）大环设计引物，即通过比对路氏锥虫和其他类似锥虫的大环序列，筛选出一对能够特异性检测路氏锥虫的引物对，所述引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；该引物对能特异性扩增出路氏锥虫的部分片段，且灵敏度高，能够检测出仅仅含有10个锥虫的样本，或者是10ng的DNA样本；利用该引物对能够快速准确的将其从其他锥虫亚属中，以及利什曼原虫（Leishmaniaamazonesis）鉴定出来，不需要昂贵的显微镜和专业的病原学知识，本专利技术所述方法的另一特点是基于大小鼠感染锥虫的尾血直接进行PCR检测，提高了检测的可操作性，检测快速方便，可用于早期感染的检测，同时适用于动物锥虫混合感染的检测，有利于开展流行病学调查以及可能适用于人类感染路氏锥虫的检测。附图说明图1为TL3对路氏锥虫PCR检测反应温度优化结果；图中：泳道M：DL2000marker，泳道1～6分别为50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃，泳道N为阴性对照。图2为TL2对路氏锥虫PCR检测反应温度优化结果；图中：泳道M：DL2000marker，泳道1～6分别为50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃，泳道N为阴性对照。图3TL1对路氏锥虫PCR检测反应温度优化结果；图中：泳道M：DL2000marker，泳道1～6分别为50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃，泳道N为阴性对照。图4为TL3对路氏锥虫PCR检测特异性结果；图中：泳道M：DL2000marker，泳道1～3为3种T.musculi（小鼠锥虫）、4～6为3种T.lewisi（路氏锥虫）、7～9为3种T.brucei（布氏锥虫）、泳道10为T.evansi（伊氏锥虫）、泳道11～13为3种T.equiperdum（马媾疫锥虫）、泳道14为T.cruzi（枯氏锥虫）、泳道15为L.amazonensis（利什曼亚马逊属）、泳道N为阴性对照。图5为TL1对路氏锥虫PCR检测特异性结果；图中：泳道M：DL2000marker，泳道1～3为3种T.musculi（小鼠锥虫）、4～6为3种T.lewisi（路氏锥虫）、7～9为3种T.brucei（布氏锥虫）、泳道10为T.evansi（伊氏锥虫）、泳道11～13为3种T.equiperdum（马媾疫锥虫）、泳道14为T.cruzi（枯氏锥虫）、泳道15为L.amazonensis（利什曼亚马逊属）、泳道N为阴性对照。图6为TL3对路氏锥虫DNA的PCR检测灵敏度结果；图中：泳道M：DL2000marker，泳道1～6分别为200ng、100ng、50ng、10ng、1ng、0.1ng，泳道N为阴性对照。图7为TL1对路氏锥虫DNA的PCR检测灵敏度结果；图中：泳道M：DL2000marker，泳道1～6分别为200ng、100ng、50ng、10ng、1ng、0.1ng，泳道N为阴性对照。图8为TL3对路氏锥虫血液PCR检测灵敏度结果；图中：泳道M：DL2000marker，泳道1～5分别为104个锥虫、103个锥虫、102个锥虫、10个锥虫、1个锥虫，泳道N为阴性对照。图9为TL1对路氏锥虫血液PCR检测灵敏度结果；图中：泳道M：DL2000marker，泳道1～5分别为104个锥虫、103个锥虫、102个锥虫、10个锥虫、1个锥虫，泳道N为阴性对照。图10为PCR检测血液样本的流程图。图11为PCR扩增目的片段，下划线英文字母标注的序列为引物结合区域。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。SNET缓冲液：100mMNaCl，10mMTris·HCl，pH8.0，25mMEDTA，pH8.0，0.5%SDS。路氏锥虫（T.lewisiCPO02）总DNA的提取：（1）在纯化过的锥虫样品中加入SNET缓冲液（在SNET缓冲液中再加入蛋白酶K，蛋白酶K的终浓度为100μg/ml），56℃金属浴消化3～5h；（2）将步骤（1）的样品取出，加入RNA酶，37℃金属浴消化0.5h；（3）将步骤（2）的样品去出，加入体积比为25：24：1的酚：氯仿：异戊醇，室温下震荡混匀成乳状液后静置2～5min；（4）将步骤（3）本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测路氏锥虫的引物对TL3‑F和TL3‑R，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测路氏锥虫的引物对TL3-F和TL3-R，其特征在于，所述引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。2.含有权利要求1所述引物对的试剂盒。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内还含有PCR扩增反应试剂。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增反应体系为：12.5μl的PCR反应试剂，引物TL3-F和引物TL3-R、100ng样本DNA，灭菌双蒸水补齐至25μl，引物TL3-F和引物TL3-...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖德华，洪晓昆，张玄，温砚子，伦照荣，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44