本发明专利技术公开了一种检测猪肺炎支原体的引物对、试剂盒及Syto9荧光定量PCR‑HRM检测方法。该方法操作简单，只需在PCR反应之前加荧光饱和染料Syto9即可；检测速度快且高通量，全部操作过程只需2～3小时，极大缩短了检测所需时间；费用低，不需要特异性荧光标记探针，每个样品的饱和染料成本为1.6 RMB；准确性高，相关系数大于0.99；特异性好，可有效区分包括猪鼻支原体、猪滑液支原体等猪病原；灵敏度高，最低检出限可低至4.56拷贝/μL；结合HRM的闭管检测技术可避免假阳性或假阴性的出现，更易于应用与推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学检测
，具体地涉及一种检测猪肺炎支原体的引物对、试剂盒及Syto9荧光定量PCR-HRM检测方法。
技术介绍
猪支原体病(MycoplasmalDiseases)是指由猪肺炎支原体（M.Hyopneumoniae，Mhp）、猪鼻支原体（M.hyorhinis，Mhr）、猪滑液支原体（M.hyosynoviae，Mhs）和猪嗜血支原体(猪附红细胞体)和絮状支原体等寄生于宿主猪，引起猪肺炎、浆膜炎、关节炎和黄疸性贫血等症状性疾病。其中，Mhp是引起猪支原体肺炎又称“喘气病”的病原微生物，其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降，其高致病率严重影响养猪业的经济效益。检测Mhp的常用方法有分离培养、核酸探针、PCR、微粒凝集试验、免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验等。虽然Mhp可以在人工培养基上生长，但对营养要求极为苛刻，且培养时间长，容易被其他病原微生物污染。血清学检测方法与其他支原体之间存在严重交叉反应，给Mhp的鉴别诊断带来了困难。随着现代分子生物学技术的快速发展，荧光PCR技术不仅克服了血清学交叉反应的缺点，而且敏感、快速、方便。荧光PCR技术大致分为荧光探针法（标记荧光PCR）和通用型的荧光染料法（非标记荧光PCR）。前者利用荧光标记的特异性探针或者引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于扩增序列专一检测，不过检测成本要高很多。而后者主要是利用荧光染料与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，其优点是：无需另外设计荧光探针，简便易行，成本较低。其中，荧光染料又分为非饱和染料（如SYBRGreen）和饱和染料（如LCGreen等）。相对SYBRGreen等非饱和染料来说，EvaGreen、LCGreen、Syto9等饱和染料具有以下优点：①饱和的染料对PCR反应没有任何抑制作用，因此可以在PCR反应之前加入，而其它非饱和荧光染料若较多加入到反应液中会抑制PCR反应，因此只能限量加入，从而对荧光PCR反应的指示受到限制。②DNA高温变性时，非饱和荧光染料加入则会造成DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生迁移，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降，而饱和染料则不会出现此类情况。③高温稳定，对于高GC含量的PCR产物，Tm值较高，在DNA双链高温熔解时，饱和荧光染料结合核酸更稳定。高分辨率熔解曲线(high-resolutionmelt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于基因突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。HRM利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录熔解曲线，从而对样品进行检测。因其操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。因此，拟开发一种基于饱和荧光染料Syto9的检测Mhp的荧光定量PCR-HRM方法，以便更好地避免假阳性和假阴性的干扰，最终为猪肺炎支原体的流行病学调查及疫情预警提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测猪肺炎支原体的引物对、试剂盒以及Syto9荧光定量PCR-HRM检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：用于检测猪肺炎支原体的荧光定量PCR引物对，其核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’-GWCAAAGTCAAAGTCAGCAAAC-3’（SEQIDNO:1）；下游引物P2：5’-AGCTGTTCAAATGCTTGTCC-3’（SEQIDNO:2）。一种检测猪肺炎支原体的Syto9荧光定量PCR-HRM方法，包括如下步骤：（1）提取待测样品DNA；（2）以步骤（1）提取的DNA为核酸模板，以Syto9为荧光染料，用权利要求1所述的用于检测猪肺炎支原体的荧光定量PCR引物对进行PCR扩增；（3）将步骤（2）获得的PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析；（4）结果判定：形成特异性的熔解曲线峰型为阳性，无特异的熔解曲线峰型为阴性。其中，步骤（2）所述的PCR扩增反应的25μL体系中含有2xTaqPlusMasterMix12.5μL，P1和P2引物（100pmol/μL）各1.0μL，核酸模板2.0μL，Syto91.0μL，余量为去离子水。其中，步骤（2）所述的PCR扩增反应程序为首先94℃5min；随后94℃20s、54.5℃20s、72℃20s，循环扩增45次；最后72℃延伸7min。其中，步骤（3）所述的高分辨率熔解曲线分析程序为98℃变性2min，40℃杂合2min，74℃～83℃以0.3℃/s的熔解速率运行。一种猪肺炎支原体的荧光定量PCR检测试剂盒，含有上述用于检测猪肺炎支原体的荧光定量PCR引物对。本专利技术的有益效果是：本专利技术建立了一种基于饱和荧光染料Syto9的荧光定量PCR-HRM方法检测猪肺炎支原体。该方法操作简单，只需在PCR反应之前加荧光饱和染料Syto9即可；检测速度快且高通量，全部操作过程只需2～3小时，极大缩短了检测所需时间；费用低，不需要特异性荧光标记探针，每个样品的饱和染料成本为1.6RMB；准确性高，相关系数大于0.99；特异性好，可有效区分包括Mhr、Mhs等猪病原；灵敏度高，最低检出限可低至4.56拷贝/μL，结合HRM的闭管检测技术可避免假阳性或假阴性的出现，更易于应用与推广。附图说明图1：猪肺炎支原体扩增曲线及HRM分析图；图2：荧光定量方法标准曲线及HRM分析图；图3：特异性实验扩增曲线图及熔解曲线图；图4：灵敏度试验扩增曲线及熔解曲线图；图5：临床样本检测图，L1~L8为8份临床肺脏样品，N1~N5为5份鼻拭子。具体实施方式用于检测猪肺炎支原体的荧光定量PCR引物对，其核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’-GWCAAAGTCAAAGTCAGCAAAC-3’（SEQIDNO:1）；下游引物P2：5’-AGCTGTTCAAATGCTTGTCC-3’（SEQIDNO:2）。一种检测猪肺炎支原体的Syto9荧光定量PCR-HRM方法，包括如下步骤：（1）提取待测样品DNA；（2）以步骤（1）提取的DNA为核酸模板，以Syto9为荧光染料，用权利要求1所述的用于检测猪肺炎支原体的荧光定量PCR引物对进行PCR扩增；（3）将步骤（2）获得的PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析；（4）结果判定：形成特异性的熔解曲线峰型为阳性，无特异的熔解曲线峰型为阴性。其中，步骤（2）所述的PCR扩增反应的25μL体系中含有2xTaqPlusMasterMix12.5μL，P1和P2引物（100pmol/μL）各1.0μL，核酸模板2.0μL，Syto91.0μL，余量为去离子水。其中，步骤（2）所述的PCR扩增反应程序为首先94℃5min；随后94℃20s、54.5℃20s、72℃20s，循环扩增45次；最后72℃延伸7min。其中，步骤（3）所述的高分辨率熔解曲线分析程序为98℃变性2min，40℃杂合2min，74℃～83℃以0.3℃/s的熔解速率运行。一种猪肺炎支原体的荧光定量PCR检测试剂盒，含有上述用于检测猪肺炎支原体的荧光定量PCR引物对。下面结合实施例对本专利技术做进一步解释，但不局限于本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测猪肺炎支原体的荧光定量PCR引物对，其特征在于：所述引物对的核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’‑ GWCAAAGTCAAAGTCAGCAAAC ‑3’；下游引物P2：5’‑ AGCTGTTCAAATGCTTGTCC ‑3’。
【技术特征摘要】
1.用于检测猪肺炎支原体的荧光定量PCR引物对，其特征在于：所述引物对的核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’-GWCAAAGTCAAAGTCAGCAAAC-3’；下游引物P2：5’-AGCTGTTCAAATGCTTGTCC-3’。2.一种检测猪肺炎支原体的Syto9荧光定量PCR-HRM方法，包括如下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)以步骤（1）提取的DNA为核酸模板，以Syto9为荧光染料，用权利要求1所述的用于检测猪肺炎支原体的荧光定量PCR引物对进行PCR扩增；(3)将步骤（2）获得的PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析；(4)结果判定：形成特异性的熔解曲线峰型为阳性，无特异的熔解曲线峰型为阴性。3.根据权利要求2所述的检测猪肺炎支原体的Syto9荧光定量PCR-HRM方法，其特征在于：步骤（2）所述的PCR扩增反应的25μL体系...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志宏，刘志成，张建峰，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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