本发明专利技术公开了一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。检测引物组包括6条特异性引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；试剂盒还可以有显色剂或荧光指示剂；其检测方法是通过提取待检猪肺炎支原体的DNA、采用6条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝，其鉴定采用反应管内沉淀的浊度变化、加入显色剂观察反应管内颜色变化、利用实时荧光检测仪观察确定待检样本是否含有或为猪肺炎支原体。本发明专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学
，涉及转猪支原体肺炎的快速检测方法，具体是一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
本专利技术涉及分子生物学
，涉及转猪支原体肺炎的快速检测方法，具体是一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及基于上述检测引物组和检测试剂盒的猪肺炎支原体的恒温基因扩增检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，正环引物LF和反环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示：外引物1：GTATTTGCCTCGGTCATTT SEQ ID No：1；外引物2：CCTTTGCTGATTATACCCAG SEQ ID No：2；内引物1：TCCCTGAATCTCTAACTCGTGAGGGGAGATATTATCAAGTTCC SEQ ID No：3；内引物2：TCGGCACGAGTTTCAAATCTTAAGAATGGATGTCGATCTTG SEQ ID No：4；正环引物LF:TCATTATTCGCCAAGTACCG SEQ ID No：5；反环引物LB:TCGATCTTAGCCAAGAAAGTC SEQ ID No：6。一种猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，包括以下成分：（1）引物液：含有权利要求1所述的引物组，浓度分别为48～52μM外引物1、48～52μM外引物2，48～52μM内引物1、48～52μM内引物2；（2）反应液：含有12 mM dNTP、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150 mM MgSO4水溶液，三者的体积比是7～9：4～6：2；（3）DNA聚合酶：浓度为7～9U/μl；作为本专利技术进一步的方案：所述引物液中含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2。作为本专利技术再进一步的方案：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl。作为本专利技术再进一步的方案：所述反应液中，12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反应缓冲液：150mM MgSO4的体积比为8：5：2。作为本专利技术再进一步的方案：还含有显色剂，所述显色剂为SYBR green/HNB染料。所述的猪肺炎支原体的检测试剂盒检测猪肺炎支原体的方法，包括如下步骤：1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取纯化样品DNA；2）恒温检测反应：在PCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用猪肺炎支原体的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃持续2min；3）结果判断：通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或者肉眼显色剂或者荧光曲线法来判断。作为本专利技术再进一步的方案：所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒检测猪肺炎支原体的方法，步骤1）中所述的煮沸法提取猪肺炎支原体的方法为：（a）将装有100 uL液体样本的1.5 mL离心管，12000 rpm, 离心1min，去上清；（b）在1.5 mL离心管中加入0.15 g玻璃珠,以及200 μL 5% Chelex100；（c）震荡仪最大转速涡旋5200rpm，涡旋震荡3min，瞬时离心后100℃，5min，12000 rpm离心2min；（d）将上清液转移至新的离心管中，作为模板备用。本专利技术基于环介导等温扩增技术（LAMP法），根据靶基因设计的六条引物能特异性识别靶基因序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎－环DNA混合物。采用4条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行，反应时间依据模板DNA质量变化，一般为90 min或更少，在45～90min的短时间内扩增效率可以达到109～1010个拷贝。加入模板DNA，在60～65℃反应45～90min后，在80℃保温2min，终止反应。在反应中，有核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中Mg离子结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：（1）快速高效：整个扩增只用45～90min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；（2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部实时荧光检测仪就能反应和检测，条件比较温和；（3）高特异性：本专利技术根据设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；（4）高灵敏度：最低检测极限可达到10个拷贝；（5）鉴定简便：可通过观察加入颜色变化、是否存在焦磷酸镁沉淀或是否出现“S”型扩增曲线来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。附图说明图1为实施例2中猪肺炎支原体LAMP引物的灵敏度测试和凝胶电泳图一。图2为实施例2中猪肺炎支原体LAMP引物的灵敏度测试和凝胶电泳图二。图3为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH1引物体系下的扩增曲线图。图4为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH 2引物体系下的扩增曲线图。图5为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH3引物体系下的扩增曲线图。图6为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH4引物体系下的扩增曲线图。图7为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH5，6,8-12引物体系下的扩增曲线图。图8为实施例3中猪肺炎支原体LAMP特异性检测曲线图之MH 7引物体系下的扩增曲线图。图9为肉眼显色反应体系在猪肺炎支原体LAMP检测体系中的应用图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒的具体使用猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和显色剂：（1）引物液：含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2，四条引物为：外引物1：GTATTTGCCTCGGTCATTT（SEQ ID No：1）；外引物2：CCTTTGCTGATTATACCCAG（SEQ ID No：2）；内引物1：TCCCTGAATCTCTAACTCGTGAGGGGAGATATTATCAA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组，其特征在于，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，正环引物LF和反环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示：外引物1：GTATTTGCCTCGGTCATTT SEQ ID No：1；外引物2：CCTTTGCTGATTATACCCAG SEQ ID No：2；内引物1：TCCCTGAATCTCTAACTCGTGAGGGGAGATATTATCAAGTTCC SEQ ID No：3；内引物2：TCGGCACGAGTTTCAAATCTTAAGAATGGATGTCGATCTTG SEQ ID No：4；正环引物LF:TCATTATTCGCCAAGTACCG SEQ ID No：5；反环引物LB:TCGATCTTAGCCAAGAAAGTC SEQ ID No：6。
【技术特征摘要】
1.一种猪肺炎支原体的LAMP检测引物组，其特征在于，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，正环引物LF和反环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示：外引物1：GTATTTGCCTCGGTCATTT SEQ ID No：1；外引物2：CCTTTGCTGATTATACCCAG SEQ ID No：2；内引物1：TCCCTGAATCTCTAACTCGTGAGGGGAGATATTATCAAGTTCC SEQ ID No：3；内引物2：TCGGCACGAGTTTCAAATCTTAAGAATGGATGTCGATCTTG SEQ ID No：4；正环引物LF:TCATTATTCGCCAAGTACCG SEQ ID No：5；反环引物LB:TCGATCTTAGCCAAGAAAGTC SEQ ID No：6。2.猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：（1）引物液：含有权利要求1所述的引物组，浓度分别为48～52μM外引物1、48～52μM外引物2，48～52μM内引物1、48～52μM内引物2；（2）反应液：含有12 mM dNTP、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150 mM MgSO4水溶液，三者的体积比是7～9：4～6：2；（3）DNA聚合酶：浓度为7～9U/μl。3.根据权利要求2所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述引物液中含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2。4.根据权利要求2所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl。5.根据权利要求2所述的猪肺炎支原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述反应液...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊炜，方雪恩，王艳，李杨，孔继烈，
申请(专利权)人：上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，复旦大学，上海速创诊断产品有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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