一种用于检测鼠痘病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法技术

本发明专利技术属生物技术领域，具体涉及一种用于检测鼠痘病毒核酸的RPA试剂盒、引物、探针及方法。本发明专利技术的试剂盒包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针如SEQ ID NO.3+FAM‑dt+THF+BHQ1‑dt+SEQ ID NO.4+C3所示。本发明专利技术的试剂盒可用于检测鼠痘病毒，反应时间短、检测速度快，且灵敏度和特异性高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测鼠痘病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测鼠痘病毒核酸的RPA试剂盒、引物、探针及方法。
技术介绍
资料公开了由鼠痘病毒(Ectromeliavirus，EV)引起的小鼠鼠痘(Mousepox)是一种高度接触性、毁灭性的烈性传染病，该病在世界各地的实验鼠群广泛流行，死亡率达96.6％。该疾患其临床以四肢、头和尾肿胀、坏死甚至脚趾脱落为特征，是危害小鼠最为严重的病毒病之一。英国Marchal等于1929年首先在英国实验鼠群中发现本病患，并于次年首次报道；我国汤飞凡1951年首次报道北京中央生物制品研究所发生鼠痘疫情；吴惠英等(1986)、徐蓓等(1989)对全国各地鼠群进行血清学流行病学调查，证实鼠痘在我国鼠群中呈散发性流行。目前本病患广泛存在于世界各国，尤以英德美法最为严重，在我国至今仍时有发生。研究显示，本病多呈爆发性流行，致死率高，常造成全群淘汰，严重影响实验动物的生产繁育，对动物实验的顺利进行和科研数据的准确性和可重复性造成极其严重的影响。研究显示，在自然条件下，鼠痘病毒可感染各种年龄的小鼠，但以乳鼠和1岁以上的老龄鼠病死率较高，而6～12周龄的小鼠较低，不同品系小鼠的易感性上有所差异；由于鼠痘病毒能隐性感染，小鼠不表现临床症状，但病毒能持久存在于体内并且繁殖，而且病毒不断地从粪便中排出，成为可怕的感染源，因此，对鼠痘的早期诊断尤其对隐性感染鼠的检出，显得尤其重要。现有技术中，血清学方法和PCR方法是检测EV最常用的方法，然而，该两种方法方法或需要昂贵的仪器设备，或需要技术娴熟的技术人员，或检测周期长，因此，不适合普通实验室或现场诊断的推广应用。2006年，一种新等温基因扩增技术——重组酶聚合酶扩增(Recombinasepolymeraseamplification，RPA)被专利技术，该技术可在37～42℃条件下、10～30min内等温体外大量扩增目的基因片段；随后，英国TwistDx公司开发出了RPA商品化试剂盒，加快了RPA技术的研发、推广和应用；与聚合酶链式反应(PCR)相比，PRA具有扩增速度快、反应温度恒定、所需仪器简单等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。目前，RPA已经在病毒、衣原体、支原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了开发与应用；该技术通过利用重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物，启动寻找模板DNA上的同源序列；当同源序列定位后，则会引发链置换反应；引物结合到对应模板上，聚合酶进而从引物3’末端开始启动DNA合成，实现在常温下两条引物对靶基因的几何级数扩增；同时，在RPA反应体系中，对引物碱基突变具有较强的耐受性，在引物个别碱基突变后，RPA反应依然可以顺利进行。实践显示，重组酶聚合酶扩增是一种可以替代PCR的核酸检测技术，其能在20分钟内进行常温下的单分子核酸检测；该技术对硬件设备的要求很低，特别适合野外及检疫现场使用。基于现有技术的基础与现状，为加强口岸对入境噬齿类实验动物和野生动物鼠痘疫情的监测和流行病学调查，本申请在建立实时荧光RPA检测EV的方法以及对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行了验证的基础上，提供一种用于检测鼠痘病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服目前对鼠痘病毒检测的灵敏度和敏感性低，且反应时间长等缺陷，基于建立实时荧光RPA检测EV的方法以及对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行验证的基础，提供一种用于检测EV核酸的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)试剂盒、引物、探针及方法。本专利技术的用RPA建立的检测EV核酸的快速检测方法具有很高的特异性和敏感性，为EV感染的诊断提供了快速、简便、准确的检测方法。本专利技术主要通过以下技术方案解决现有技术存在的技术问题。本专利技术提供了一种用于检测鼠痘病毒(EV)核酸的试剂盒，其包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述探针如SEQIDNO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQIDNO.4+C3所示。为提高扩增效率，所述的RPA反应体系的引物的浓度较佳地分别为5～20μM，更佳地为10μM；所述探针的浓度较佳地为5～10μM，更佳地为10μM。较佳地，所述的RPA反应体系还包括核心反应液、反应缓冲液、Exo反应液、探针酶混合物、醋酸镁和dNTP；其中，所述醋酸镁的浓度优选260～300μM，更优选280μM。所述dNTP的浓度优选20～220μM，更优选200μM。在本专利技术一较佳实施例中，所述的引物探针混合液由所述引物对和所述探针组成，所述引物对中各引物的量为2.1μL、浓度为10μM，所述探针的量为0.6μL、浓度为10μM。所述核心反应液的量为2.5μL，所述反应缓冲液的量为25μL，所述探针酶混合物的量为5μL，以及所述Exo反应液的量为1μL；所述醋酸镁的量为2.5μL、浓度为280μM；所述dNTP的量为7.2μL、浓度为11mM。其中：所述的核心反应液优选20倍核心反应液(即：20×核心反应液；下同)。所述的反应缓冲液优选2倍反应缓冲液。所述的探针酶混合物优选10倍探针酶混合物；所述的Exo反应液优选50倍Exo反应液更佳地，为了更直观、准确地判定检测结果，所述的试剂盒还包括阴性对照，所述的阴性对照优选ddH2O。本专利技术还提供一种检测鼠痘病毒(EV)核酸的引物对，所述的引物对的核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。本专利技术还提供一种检测鼠痘病毒(EV)核酸的探针，所述的探针如SEQIDNO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQIDNO.4+C3所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。本专利技术还提供一种检测鼠痘病毒(EV)核酸的组合，所述的组合包括引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述探针如SEQIDNO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQIDNO.4+C3所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。本专利技术还提供如上所述的引物对和/或探针，或者所述的组合在制备检测鼠痘病毒(EV)的试剂盒中的应用。本专利技术还提供一种非诊断目的的检测鼠痘病毒(EV)的方法，其包括如下步骤：(1)使用DNA提取试剂提取待检样品中的总DNA；(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用如上所述试剂盒中的RPA反应体系进行RPA反应，所述RPA反应中扩增反应的时间优选25min、温度优选39℃；(3)分析检测结果。利用本方法分别检测鼠的其它病毒，如小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠细小病毒(MPV)、小鼠仙台病毒(SV)、小鼠呼肠孤病病毒III型(Reo-3)、小鼠微小病毒(MVM)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测鼠痘病毒核酸的试剂盒，其包括RPA反应体系，其特征在于，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鼠痘病毒核酸的试剂盒，其包括RPA反应体系，其特征在于，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述探针如SEQIDNO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQIDNO.4+C3所示。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA反应体系的引物的浓度均为5～20μM，较佳地为10μM；所述探针的浓度为5～10μM，较佳地为10μM。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA反应体系还包括核心反应液、反应缓冲液、Exo反应液、探针酶混合物、醋酸镁和dNTP；较佳地：所述醋酸镁的浓度为260～300μM，优选280μM；
和/或，所述dNTP的浓度为20～220μM，优选200μM。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物探针混合液由所述引物对和所述探针组成，所述引物对中各引物的量为2.1μL、浓度为10μM，所述探针的量为0.6μL、浓度为10μM；所述核心反应液的量为2.5μL，所述反应缓冲液的量为25μL，所述探针酶混合物的量为5μL，以及所述Exo反应液的量为1μL；所述醋酸镁的量为2.5μL、浓度为280μM；所述dNTP的量为7.2μL、浓度为11mM；较佳地：所述的核心反应液为20倍核心反应液；
和/或，所述的反应缓冲液为2倍反应缓冲液；
和/或，所述的探针酶混合物为10倍探针酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊炜，薛俊欣，魏晓锋，林颖峥，李健，
申请(专利权)人：上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海实验动物研究中心，
类型：发明
国别省市：上海;31