核酸扩增方法及其应用技术

本文公开了一种核酸扩增方法，包括向扩增反应体系中加入切刻内切酶和可以在扩增反应过程中形成该切刻内切酶的识别位点的扩增引物。本发明专利技术的核酸扩增方法可以以单链或双链DNA分子或RNA分子为模板在恒温条件下进行扩增反应，操作简便，反应快速，灵敏度高，可方便地应用于疾病诊断或病原体的检测。

【技术实现步骤摘要】
核酸扩增方法及其应用
本公开涉及核酸扩增方法，尤其是利用切刻内切酶的恒温核酸扩增方法。本公开还涉及该核酸扩增方法在细菌或病毒检测方面的应用。
技术介绍
核酸扩增技术在生化分析、分子诊断、食品安全等领域具有重要意义。近几年，核酸扩增技术飞速发展，尤其是由Dr.Mullis于1983年专利技术的聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)技术已是目前应用最为广泛的核酸扩增技术。PCR技术有三个基本步骤，即：变性、退火和延伸，这使得PCR扩增需要反复升降温过程，从而对仪器设备要求十分严苛，同时PCR技术也需要熟练的专业技术人员在实验室中进行操作，这些都限制了PCR技术的广泛应用。近些年新开发出的恒温核酸扩增技术克服了PCR技术的一些缺陷，例如其不需要反复升降温，降低了对仪器设备的要求，缩短了反应时间。目前，国内外已报道了多种恒温核酸扩增技术，其中以重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)、解旋酶依赖性恒温DNA扩增(Helicase-dependentIsothermalDNAAmplification，HDA)、环介导恒温扩增(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)、滚环扩增(RollingCircleAmplification，RCA)和指数扩增反应(ExponentialAmplificationReaction，EXPAR)等为代表。但是，这些恒温核酸扩增技术也还存在扩增速度慢、扩增片段短、成本较高或操作不够简便等方面的问题。
技术实现思路
为了克服上述问题，在一方面，本公开提供了一种核酸扩增方法，其包括向扩增反应体系中加入以下组分：1)包括待扩增靶片段的靶核酸，所述待扩增靶片段从5’端至3’端依次包括5’端序列、中间序列和3’端序列；2)切刻内切酶；3)DNA聚合酶，其具有链置换活性，缺乏5’→3’外切酶活性；以及4)核心引物对，所述核心引物对包括：a)正向核心引物，其从5’端至3’端依次包括正向核心引物第一序列、正向核心引物第二序列和正向核心引物第三序列，其中所述正向核心引物第一序列和所述正向核心引物第二序列的连接处被设计为所述切刻内切酶的切割位点；所述正向核心引物第三序列的核苷酸序列与所述待扩增片段的5’端序列相同；和b)反向核心引物，其从5’端至3’端依次包括反向核心引物第一序列和反向核心引物第二序列，所述反向核心引物第一序列的核苷酸序列与所述正向核心引物第二序列相同或者为所述正向核心引物第二序列的3’端序列的一部分；所述反向核心引物第二序列的核苷酸序列与所述待扩增片段的3’端序列反向互补。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述扩增反应体系中加入置换引物对，所述置换引物对包括：a)正向置换引物，其核苷酸序列与所述靶核酸中所述待扩增靶片段的上游序列的一部分相同；和b)反向置换引物，其核苷酸序列与所述靶核酸中所述待扩增靶片段的下游序列的一部分反向互补。在一些实施方案中，所述方法在恒温情况下进行。在一些实施方案中，所述待扩增靶片段的长度为20至1000个碱基。优选地，所述待扩增靶片段的长度为40至400个碱基。在一些实施方案中，所述方法生成的扩增产物包括双链DNA分子和茎环结构DNA分子。在一些实施方案中，所述双链DNA分子的一条链从5’端到3’端依次包括：所述正向核心引物第二序列；所述待扩增靶片段；以及所述正向核心引物第二序列的反向互补序列。在一些实施方案中，所述茎环结构DNA分子包括：所述正向核心引物第二序列；所述待扩增靶片段或其互补序列；以及所述正向核心引物第二序列的反向互补序列；其中所述正向核心引物第二序列和所述正向核心引物第二序列的反向互补序列形成茎部，所述待扩增靶片段或其互补序列形成环部。在一些实施方案中，所述茎环结构DNA分子的Tm值不低于所述扩增反应体系的反应温度。在一些实施方案中，所述正向核心引物与所述靶核酸的互补链结合形成的双链的Tm值不小于所述正向置换引物与所述靶核酸的互补链结合形成的双链的Tm值，并且所述反向核心引物与所述靶核酸链结合形成的双链的Tm值不小于所述反向置换引物与所述靶核酸链结合形成的双链的Tm值。在一些实施方案中，所述正向核心引物第一序列与其互补链形成的双链的Tm值不小于正向核心引物第二序列与其互补链形成的双链的Tm值，并且这二者都不小于所述扩增反应体系的反应温度。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述反应体系中加入核酸染料或荧光探针，用于监测扩增反应进展。在一些实施方案中，所述荧光探针为DNA分子信标、PNA分子信标或双链探针。在一些实施方案中，所述双链探针包括DNA长链和DNA短链，所述DNA短链与所述DNA长链的3’端序列或5’端序列互补，并且在所述DNA长链和DNA短链的两互补末端上分别连接有荧光分子和淬灭分子。在一些实施方案中，所述荧光探针包括与所述茎环结构产物DNA分子的环部互补的序列。在一些实施方案中，所述靶核酸在所述待扩增靶片段的上游具有所述切刻内切酶的识别位点。在一些实施方案中，所述靶核酸为单链或双链DNA。在一些实施方案中，所述靶核酸为RNA，并且所述DNA聚合酶具有反转录酶活性。另一方面，本公开提供了一种检测样品中是否存在靶核酸的方法，包括以本公开的扩增所述靶核酸的特异核苷酸序列，其中能够获得所述特异核苷酸序列的扩增产物表明所述样品中存在所述靶核酸。另一方面，本公开提供了一种检测样品中是否存在细菌或病毒的方法，包括：1)从所述样品中提取核酸；以及2)以本公开的方法扩增所述细菌或病毒的特异核苷酸序列，其中能够获得所述特异核苷酸序列的扩增产物表明所述样品中存在所述细菌或病毒。本文提供的核酸扩增方法利用特别设计的引物对，联合DNA聚合酶和切刻内切酶，在恒温条件下即可实现靶核酸的指数扩增，操作简便，反应快速，灵敏度高。扩增产物为包括待扩增片段的双链DNA分子和单链茎环结构DNA分子，能够与多种检测方式联合使用，方便地应用于疾病诊断或病原体的检测。附图说明图1为本专利技术的核酸扩增方法的优选实施方案的扩增原理示意图。图2为利用本专利技术的扩增方法扩增肺炎支原体核酸片段的一个实施例的扩增过程曲线图。图3为利用本专利技术的扩增方法扩增肺炎支原体核酸片段的另一个实施例的扩增过程曲线图。该实施例不使用置换引物。图4为利用本专利技术的扩增方法扩增肺炎支原体核酸片段的另一个实施例的扩增过程曲线图。该实施例采用双链DNA探针进行扩增过程的监测。图5为利用本专利技术的扩增方法扩增乙肝病毒核酸的一个实施例的扩增过程曲线图。图6为利用本专利技术的扩增方法扩增甲型H1N1流感病毒核酸的一个实施例的扩增过程曲线图。图7为对于特定序列利用软本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸扩增方法，包括向扩增反应体系中加入以下组分：/n1)包括待扩增靶片段的靶核酸，所述待扩增靶片段从5’端至3’端依次包括5’端序列、中间序列和3’端序列；/n2)切刻内切酶；/n3)DNA聚合酶，其具有链置换活性，缺乏5’→3’外切酶活性；以及/n4)核心引物对，所述核心引物对包括：/na)正向核心引物，其从5’端至3’端依次包括正向核心引物第一序列、正向核心引物第二序列和正向核心引物第三序列，其中所述正向核心引物第一序列和所述正向核心引物第二序列的连接处被设计为所述切刻内切酶的切割位点；所述正向核心引物第三序列的核苷酸序列与所述待扩增片段的5’端序列相同；和/nb)反向核心引物，其从5’端至3’端依次包括反向核心引物第一序列和反向核心引物第二序列，所述反向核心引物第一序列的核苷酸序列与所述正向核心引物第二序列相同或者为所述正向核心引物第二序列的3’端序列的一部分；所述反向核心引物第二序列的核苷酸序列与所述待扩增片段的3’端序列反向互补。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸扩增方法，包括向扩增反应体系中加入以下组分：
1)包括待扩增靶片段的靶核酸，所述待扩增靶片段从5’端至3’端依次包括5’端序列、中间序列和3’端序列；
2)切刻内切酶；
3)DNA聚合酶，其具有链置换活性，缺乏5’→3’外切酶活性；以及
4)核心引物对，所述核心引物对包括：
a)正向核心引物，其从5’端至3’端依次包括正向核心引物第一序列、正向核心引物第二序列和正向核心引物第三序列，其中所述正向核心引物第一序列和所述正向核心引物第二序列的连接处被设计为所述切刻内切酶的切割位点；所述正向核心引物第三序列的核苷酸序列与所述待扩增片段的5’端序列相同；和
b)反向核心引物，其从5’端至3’端依次包括反向核心引物第一序列和反向核心引物第二序列，所述反向核心引物第一序列的核苷酸序列与所述正向核心引物第二序列相同或者为所述正向核心引物第二序列的3’端序列的一部分；所述反向核心引物第二序列的核苷酸序列与所述待扩增片段的3’端序列反向互补。


2.如权利要求1所述的核酸扩增方法，还包括向所述扩增反应体系中加入置换引物对，所述置换引物对包括：
a)正向置换引物，其核苷酸序列与所述靶核酸中所述待扩增靶片段的上游序列的一部分相同；和
b)反向置换引物，其核苷酸序列与所述靶核酸中所述待扩增靶片段的下游序列的一部分反向互补。


3.如权利要求1或2所述的核酸扩增方法，其在恒温情况下进行。


4.如权利要求1至3任一项所述的核酸扩增方法，其中所述待扩增靶片段的长度为20至1000个碱基。


5.如权利要求1至4任一项所述的核酸扩增方法，其中所述待扩增靶片段的长度为40至400个碱基。


6.如权利要求1至5任一项所述的核酸扩增方法，其扩增产物包括双链DNA分子和茎环结构DNA分子。


7.如权利要求1至6任一项所述的核酸扩增方法，其中所述双链DNA分子的一条链从5’端到3’端依次包括：
所述正向核心引物第二序列；
所述待扩增靶片段；以及
所述正向核心引物第二序列的反向互补序列。


8.如权利要求1至7任一项所述的核酸扩增方法，其中所述茎环结构DNA分子包括：
所述正向核心引物第二序列；
所述待扩增靶片段或其互补序列；以及
所述正向核心引物第二序列的反向互补序列；
其中所述正向核心引物第二序列和所述正向核心引物第二序列的反向互补序列形成茎部，所述待扩增靶片段或其互补序列形...

【专利技术属性】
技术研发人员：王一凡，梁振伟，蒲珏，
申请(专利权)人：北京艾克伦医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11