粪便样本保存液和粪便DNA提取方法技术

本文提供了一种粪便样本保存液，其包括20

【技术实现步骤摘要】
粪便样本保存液和粪便DNA提取方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及人源性粪便样本DNA保存和提取方法。

技术介绍

[0002]粪便样本采集简单，无创伤性，无侵入性，相较于结肠镜检测这种侵入性结直肠癌检查的方式，更易于得到大众的接受。肠癌细胞脱落后首先直接进入粪便样本，通过检测粪便样本中癌细胞状况能更早的预测肠癌的发生和发展。因此，对于肠癌检测而言，粪便样本是一种理想的分析检测样本。
[0003]但粪便样本成分复杂，存在多种抑制后续PCR反应的杂质，如肠道菌群、腐殖质、多糖、胆酸等。且不同人、同人不同时段的粪便样本中杂质组分及含量也可能存在较大差异，这些都对粪便样本中人源DNA的提取造成重大的挑战。而从粪便样本中提取出高质量的人源DNA是进行结直肠癌基因甲基化检测的前提，因此需要一种行之有效的粪便人源DNA提取试剂保障后续结直肠癌检测。
[0004]目前，商品化粪便样本人源DNA提取试剂盒，有效率较低，对粪便样本普适性较差，对许多成分复杂的粪便样本无法有效去除其中杂质，仅适用于一部分粪便样本，或者对成分复杂的粪便样本提取效果较差，导致后续PCR检测效果不佳，严重影响了结直肠癌检测效果。
[0005]因此，结直肠癌基因甲基化早期诊断需要一种高效、高普适性的粪便样本人源DNA提取方法，才能最大限度的保障早期结直肠癌甚至进展期腺瘤的预测检出。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，得到更为高效、高普适性的粪便样本人源DNA结果，本专利技术公开方法如下。
[0007]一种粪便样本保存液，其包括20
‑
500mM的Tris，20
‑
500mM的EDTA，0.9％的NaCl或KCl，0
‑
1％的SDS，1
‑
20％的乙醇、乙二醇、异丙醇、PEG或DMSO，0.05％
‑
0.5％的Triton X
‑
100、吐温20或NP
‑
40。
[0008]在一些实施方案中，所述粪便样本保存液的pH为7.0
‑
8.0。
[0009]一种粪便DNA提取方法，包括以下步骤：
[0010]步骤一：取新鲜成型的固态粪便置入装有样本保持试剂的粪便样本保存管中后混匀，制备粪便样本；所述粪便样本保存液包括：20
‑
500mM的Tris，20
‑
500mM的EDTA，0.9％的NaCl或KCl，0
‑
1％的SDS，1
‑
20％的乙醇、乙二醇、异丙醇、PEG或DMSO，0.05％
‑
0.5％的Triton X
‑
100、吐温20或NP
‑
40，pH 7.0
‑
8.0；
[0011]步骤二：提取所述粪便样本中的DNA，包括：
[0012](1)样本前处理：将所述粪便样本匀浆后离心，取出上层液体备用；
[0013](2)裂解：将步骤(1)的上层液体与裂解缓冲液以5:1至15:1(v/v)的比例混匀3
‑
10min后离心取上清液；
[0014](3)去杂质：将步骤(2)获得的上清液置入杂质吸附管中吸附5
‑
15min后，离心取上清液，加入1/2体积的杂质清除液A混匀3
‑
10min后离心，取上清液，再加入等体积杂质清除液B混匀3
‑
10min后离心，向离心后所获得的上清液中加入1/50
‑
1/10(v/v)的20mg/mL蛋白酶K溶液，在56
‑
65℃温度下孵育30
‑
60min，得到消化处理液；
[0015](4)纯化：向所述消化处理液中加入1/2体积的无水乙醇，1/10
‑
1/5体积的磁珠吸附液，使用圆盘旋转混匀仪以10
‑
30rpm旋转混匀10
‑
30min，使用磁力架磁吸附磁珠，所述磁珠经过清洗缓冲液A与清洗缓冲液B清洗所述磁珠后晾干；
[0016](5)洗脱：加入30
‑
100μL洗脱缓冲液洗脱DNA，磁吸附去除所述磁珠后得到的上清液即为含DNA的保存液，
[0017]其中所述杂质吸附管含有经冻干的杂质吸附试剂，所述杂质吸附试剂在冻干前包括5
‑
100mM的Tris
‑
HCl、200mg/mL的BSA、20
‑
100mg/mL的PVPP和5
‑
50mM的EDTA，pH 7.0
‑
8.0；
[0018]所述的裂解缓冲液包括20
‑
200mM的Tris
‑
HCl、0.5％
‑
2％的SDS、0.5％
‑
2％的PVP、5
‑
50mM的EDTA和0
‑
10％的甲酰胺，pH 7.0
‑
8.0；
[0019]所述的杂质清除液A包括20
‑
100mM的Tris
‑
Ac、3
‑
5M的硫氰酸胍和50
‑
500mM的KAc，pH 5.0
‑
7.0；
[0020]所述的杂质清除液B包括20
‑
100mM的Tris
‑
Ac、20
‑
200mM的硫酸铝铵、20
‑
200mM的硫酸铝钾和50
‑
200mM的醋酸铵，pH 5.0
‑
7.0；
[0021]所述的清洗缓冲液A包括2
‑
100mM的Tris
‑
HCl、0.1％
‑
1％的Tween 20、0.5
‑
5mM的EDTA和50％
‑
60％的乙醇，pH 7.0
‑
8.0；
[0022]所述的清洗缓冲液B包括2
‑
100mM的Tris
‑
HCl、0.05
‑
2mM的EDTA和70％
‑
80％的乙醇，pH 7.0
‑
8.0；
[0023]所述的洗脱缓冲液包括2
‑
100mM的Tris
‑
HCl和0.02
‑
0.2mM的EDTA，pH 7.0
‑
8.0。
[0024]在一些实施方案中，所述固态粪便(g)与所述粪便样本保存液(mL)的比例为1:2
‑
1:4，优选为1:3。
[0025]在一些实施方案中，所述固态粪便离开人体时间不超过6小时，优选不超过3小时，最优选所述固态粪便离开人体后直接采集进入所述粪便样本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种粪便样本保存液，其包括20
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500mM的Tris，20
‑
500mM的EDTA，0.9％的NaCl或KCl，0
‑
1％的SDS，1
‑
20％的乙醇、乙二醇、异丙醇、PEG或DMSO，0.05％
‑
0.5％的Triton X
‑
100、吐温20或NP
‑
40。2.一种粪便DNA提取方法，包括以下步骤：步骤一：取新鲜成型的固态粪便置入装有粪便样本保存液的粪便样本保存管中后混匀，制备粪便样本；所述粪便样本保存液包括：20
‑
500mM的Tris，20
‑
500mM的EDTA，0.9％的NaCl或KCl，0
‑
1％的SDS，1
‑
20％的乙醇、乙二醇、异丙醇、PEG或DMSO，0.05％
‑
0.5％的Triton X
‑
100、吐温20或NP
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40，pH 7.0
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8.0；步骤二：提取所述粪便样本中的DNA，包括：(1)样本前处理：将所述粪便样本匀浆后离心，取出上层液体备用；(2)裂解：将步骤(1)的上层液体与裂解缓冲液以5:1至15:1(v/v)的比例混匀3
‑
10min后离心取上清液；(3)去杂质：将步骤(2)获得的上清液置入杂质吸附管中吸附5
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15min后，离心取上清液，加入1/2体积的杂质清除液A混匀3
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10min后离心，取上清液，再加入等体积杂质清除液B混匀3
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10min后离心，向离心后所获得的上清液中加入1/50
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1/10(v/v)的20mg/mL蛋白酶K溶液，在56
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65℃温度下孵育30
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60min，得到消化处理液；(4)纯化：向所述消化处理液中加入1/2体积的无水乙醇，1/10
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1/5体积的磁珠吸附液，使用圆盘旋转混匀仪以10
‑
30rpm旋转混匀10
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30min，使用磁力架磁吸附磁珠，所述磁珠经过清洗缓冲液A与清洗缓冲液B清洗所述磁珠后晾干；(5)洗脱：加入30
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100μL洗脱缓冲液洗脱DNA，磁吸附去除所述磁珠后得到的上清液即为含DNA的保存液，其中所述杂质吸附管含有经冻干的杂质吸附试剂，所述杂质吸附试剂在冻干前包括5
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100mM的Tris
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【专利技术属性】
技术研发人员：王一凡，于洋，胡鹏程，李明明，蒲珏，
申请(专利权)人：北京艾克伦医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：