基于LEAPER技术治疗MPSI的方法和组合物技术

本申请公开了一种基于LEAPER技术治疗MPSI的方法和组合物，所述方法包括将包含用于编辑靶标RNA的腺苷脱氨酶招募RNA(arRNA)或编码所述arRNA的构建体导入所述细胞中，其中，所述arRNA包含与所述靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且，所述arRNA招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以使靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基；所述arRNA为环状RNA或能够形成环状RNA的RNA，所述方法针对W402位点设计的环状RNA，整体编辑能力提高到优化前的3倍左右，同时在非目标位点编辑的编辑效率相对于目标位点编辑的编辑效率，占比由优化前的7％降为优化后的低于0.5％。0.5％。

【技术实现步骤摘要】
基于LEAPER技术治疗MPSI的方法和组合物


[0001]本申请涉及基因编辑
，尤其涉及一种基于LEAPER技术治疗MPSI的方法和组合物。

技术介绍

[0002]赫勒氏综合征(Hurler syndrome)，又称粘多糖贮积症IH型(Mucopolysaccharidoses IH，MPS IH)，是MPSI型三种亚型IH、IH/S、IS中最严重的一种，它是由于该病患者体内α
‑
L
‑
艾杜糖醛酸酶(α
‑
L
‑
iduronidase，IDUA)缺乏而引起的一种致残、致死性的遗传性代谢病，为常染色体隐性遗传病(autosomal recessive，AR)。导致赫勒氏综合征的根本原因，是位于人4号染色体上4p16.3编码IDUA蛋白的IDUA基因突变导致的，到目前为止它的致病突变有200多种，其中最为常见的一种类型是位于α
‑
L
‑
艾杜糖醛酸苷酶cDNA上1205位G到A的突变，该突变导致原本的色氨酸变为终止密码子，进而使最终翻译出来的蛋白上缺乏该位点之后的全部氨基酸(NM_000203.4(IDUA)
‑
c.1205G>A(p.Trp402Ter))而丧失IDUA全部酶活性。该突变类型可占到总发病人群的63％(Worldwide distribution of common IDUA pathogenic variants，Poletto,Edina(2018).Clinical Genetics.94.10.1111/cge.13224.)。IDUA是负责细胞溶酶体(lysosomes)内葡糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)降解的。赫勒氏综合征的病人个体间差异较大，出生时可为正常，3
‑
6个月时最早出现的征兆为面部轮廓粗糙，随后出现额骨突出、骨骼畸形、生长停滞、语言障碍等症状，病人通常活不过10岁。
[0003]目前赫勒氏综合征没有治愈方法，已知批准两种治疗方法：酶替代疗法(ERT)和造血干细胞移植(HSCT)。ERT在内脏表型方面取得了良好的效果，包括减少肝脏大小、呼吸功能改善、患者活动性全面改善；不利的是，它不能到达中枢神经系统，因此不能阻止认知障碍。HSCT成功可预防大多数临床症状，包括神经系统症状，但必须在出现临床症状前进行治疗(最好在8个月大之前)，但由于这种治疗方法的死亡率高所以只适用于病情严重的患者(Combination of enzyme replacement and hematopoietic stem cell transplantation as therapy for Hurler Syndrome.Tolar,J(2008).Bone marrow transplantation.4.531
‑
5.10.1038/sj.bmt.1705934)。
[0004]目前，本领域正在研究中的赫勒氏综合征基因疗法包括：
[0005]①
利用锌指核糖核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)和腺相关病毒(Adeno
‑
associated virus，AAV)将编码正常IDUA蛋白的cDNA序列定点插入到肝细胞的基因组中，但这种方法仍旧无法解决赫勒氏综合征中大脑骨骼等系统的症状。
[0006]②
通过DNA编辑进行治疗也是目前一种较为有前景的疗法开发思路，但其可能产生的脱靶(off
‑
target)是需要高度关注的问题。
[0007]理论上，近年来正在飞速发展的基因组编辑技术CRISPR可以用来治疗赫勒氏综合征。许多科研工作者和生物技术公司也在致力于将该技术推上临床。尽管CRISPR技术存在极大的潜在应用前景，但也存在一系列缺陷，导致该技术从科研阶段向临床治疗应用中的
转化步履维艰。问题之一便是基于CRISPR的DNA编辑技术，必须通过外源表达Cas9或拥有相似功能的其它核酸酶，从而造成了以下几个问题：首先，通常需要外源表达的核酸酶具有较大分子量，这使得通过病毒载体将其递送至体内的效率急剧下降；其次，由于核酸酶的外源表达，使得其存在潜在的核酸酶脱靶可能，使得其应用具有潜在的致癌风险；最后，外源表达的核酸酶是从细菌中发现的，而非人类或哺乳动物天然存在的，这使得其可能引起患者体内的免疫反应，这一方面可能会对患者自身造成损伤，另一方面也可能会使外源表达的核酸酶被中和，从而失去应有的活性，或者阻碍进一步的干预治疗。
[0008]2017年，张锋课题组曾报道一种名为REPAIR(RNA Editing for Programmable A to I Replacement)的RNA编辑技术(RNA editing with CRISPR
‑
Cas13，Cox et al.,2017)，该技术通过外源表达Cas13
‑
ADAR融合蛋白及单独向导RNA(single guide RNA,sgRNA)可以实现靶向目标RNA的A到I的编辑，但是该方法同CRISPR技术一样，仍需要外源蛋白的表达。无法解决外源蛋白表达造成的问题。
[0009]2017年，国际申请PCT/EP2017/071912曾公开了一种更加适用于体内编辑的方法。该方法无需外源蛋白，仅依靠向细胞中引入一小段与目的位点所在序列互补配对的RNA，即可招募ADAR蛋白对RNA目的位点进行编辑。该方法所采用的互补RNA长度短(不足54nt)，但需要复杂的化学修饰，且编辑效率不高。
[0010]2019年1月，Thorsten Stafforst课题组曾报道一种名为RESTORE的核酸编辑技术(recruiting endogenous ADAR to specific trans for oligonucleotide
‑
mediated RNA editing,Merkle et al.,2019)。该技术能够摆脱对外源蛋白的依赖，但RESTORE技术需要在IFN
‑
γ存在的前提下才能有较高的编辑效率，而IFN
‑
γ是决定自体免疫发展和严重程度的关键因子(Interferon
‑
γand systemic autoimmunity.,Pollard et al.,2013，这使得该技术在医学领域的应用大打折扣。
[0011]PCT/CN/2019/110782和PCT/CN2020/084922中记载了一种RNA编辑方法，称为LEAPER(Leaper 1.0)，即一种依靠向细胞中引入一段与目的位点所在序列互补配对的RNA，招募ADAR蛋白对RNA目的位点进行编辑的技术。该技术所使用的与目的位点所在序列互补配对的RNA可以在不经任何修饰的情况下，激发针对目的位点较为高效的RNA编辑。
[0012]WO20210084本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LEAPER技术靶向编辑靶标细胞中靶标RNA的方法，其中所述靶标RNA为IDUA编码基因中含有G到A突变的RNA，所述方法包括：将包含用于编辑靶标RNA的腺苷脱氨酶招募RNA(arRNA)或编码所述arRNA的构建体导入所述细胞中，其中，所述arRNA包含与所述靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且，所述arRNA招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以使靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基；所述arRNA为环状RNA或能够形成环状RNA的RNA；在所述arRNA中靶向碱基距离该arRNA 3
’
端的长度短于距离该arRNA5
’
端的长度；所述arRNA的5
’
端和/或3
’
端连接AC linker。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述arRNA中靶向碱基距离该arRNA3
’
端的长度为15nt
‑
55nt、15nt
‑
45nt、15nt
‑
35nt、15nt
‑
25nt、25nt
‑
55nt、25nt
‑
45nt、25nt
‑
35nt、35nt
‑
55nt、35nt
‑
45nt、45nt
‑
55nt中的任一整数个nt；优选的，在所述arRNA中靶向碱基距离该arRNA5
’
端的长度为55nt
‑
95nt、55nt
‑
85nt、55nt
‑
75nt、55nt
‑
65nt、65nt
‑
95nt、65nt
‑
85nt、65nt
‑
75nt、75nt
‑
95nt、75nt
‑
85nt、85nt
‑
95nt中任一整数个nt；优选的，所述arRNA的长度选自下述的任一种：95nt
‑
c
‑
55nt、85nt
‑
c
‑
55nt、75nt
‑
c
‑
55nt、65nt
‑
c
‑
55nt、95nt
‑
c
‑
45nt、85nt
‑
c
‑
45nt、75nt
‑
c
‑
45nt、65nt
‑
c
‑
45nt、55nt
‑
c
‑
45nt、95nt
‑
c
‑
35nt、85nt
‑
c
‑
35nt、75nt
‑
c
‑
35nt、65nt
‑
c
‑
35nt、55nt
‑
c
‑
35nt、95nt
‑
c
‑
25nt、85nt
‑
c
‑
25nt、75nt
‑
c
‑
25nt、65nt
‑
c
‑
25nt、55nt
‑
c
‑
25nt、95nt
‑
c
‑
15nt、85nt
‑
c
‑
15nt、75nt
‑
c
‑
15nt、65nt
‑
c
‑
15nt和55nt
‑
c
‑
15nt，优选选自下述的任一种：95nt
‑
c
‑
35nt、85nt
‑
c
‑
35nt、75nt
‑
c
‑
35nt、65nt
‑
c
‑
35nt、95nt
‑
c
‑
25nt、85nt
‑
c
‑
25nt、75nt
‑
c
‑
25nt、65nt
‑
c
‑
25nt、95nt
‑
c
‑
15nt、85nt
‑
c
‑
15nt、75nt
‑
c
‑
15nt和65nt
‑
c
‑
15nt，所述arRNA为5
’
端到3
’
端方向。3.根据权利要求1
‑
2中任一项所述的方法，其中，所述靶标细胞为真核细胞，优选为哺乳动物细胞，进一步优选为人细胞或鼠细胞。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中，所述靶标RNA包含W402X的突变位点。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中，所述AC linker的长度为小于等于70nt中的任一整数个nt，优选为10nt
‑
50nt、10nt
‑
40nt、10nt
‑
30nt、10
‑
20ntnt、20nt
‑
50nt、20nt
‑
40nt、20nt
‑
30nt、30nt
‑
50nt、30nt
‑
40nt、40nt
‑
50nt中的任一整数nt；优选的，所述arRNA靶向的序列选自SEQ ID NO:17
‑
SEQ ID NO:40中的任一种，优选为选自下述中的任一种：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中，在arRNA的靶向位点的3
’
端方向和/或5
’
端方向引入n个碱基错配和/或碱基缺失，n为0
‑
6、1
‑
6、2
‑
6、3
‑
6、4
‑
6、5
‑
6、0
‑
5、1
‑
5、2
‑
5、3
‑
5、4
‑
5、0
‑
4、1
‑
4、2
‑
4、3
‑
4、0
‑
3、1
‑
3、2
‑
3的任一整数；优选的，在arRNA的靶向位点的5
’
端方向引入1、2、3、4或5个碱基错配和/或碱基缺失；和/或在arRNA的靶向位点的3
’
端方向引入0、1、2、3或4个碱基错配和/或碱基缺失。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中，所述编码所述arRNA的构建体为核酸链、病毒载体或质粒；
优选的，所述病毒载体为腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒表达载体。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中，导入方式为电转染、脂质体转染、外泌体递送或脂质
‑
纳米颗粒递送(NLP)，优选为脂质体转染。9.一种工程化arRNA，所述arRNA用于通过LEAPER技术靶向编辑靶标细胞中靶标RNA，其中，所述靶标RNA为IDUA编码基因中含有G到A突变的RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁鹏飞，赵艳霞，刘恋，霍雷，孙雪晴，
申请(专利权)人：北京辑因医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：