编辑RNA的方法和组合物技术

本发明专利技术提供一种通过在宿主细胞中引入脱氨酶募集RNA来编辑RNA的方法，用于使靶标RNA中的腺苷脱氨基，和在所述RNA编辑方法中使用的脱氨酶募集RNA，以及包含它的组合物。以及包含它的组合物。

【技术实现步骤摘要】
编辑RNA的方法和组合物
[0001]本申请是申请号为201980067380.1、专利技术名称为“编辑RNA的方法和组合物”的中国专利申请的分案申请。
[0002]对相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求于2018年10月12日提交的国际申请号PCT/CN2018/110105的国际申请，和于2019年4月15日提交的国际申请号CN2019/082713的国际申请的优先权，其内容在此通过提及以其整体并入。
[0004]以ASCII文本文件提交序列表
[0005]以下以ASCII文本文件提交的内容在此通过提及以其整体并入：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：FC00158PCT
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zhc.TXT，记录日期：2019年10月11日，大小：104KB)。


[0006]本专利技术涉及利用工程化RNA来编辑RNA的方法和组合物，工程化RNA能够募集腺苷脱氨酶用以使靶标RNA中的一个或多个腺苷脱氨基。

技术介绍

[0007]基因组编辑是生物医学研究和疾病疗法开发的有力工具。到目前为止，最流行的基因编辑技术是成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)
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Cas系统，它是从细菌和古细菌的适应性免疫系统开发出来的。CRISPR
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Cas可以精确打靶和切割基因组DNA，从而产生双链DNA断裂(DSB)。DSB可以通过非同源末端连接(NHEJ)途径修复，导致插入或缺失(Indel)，后者在大多数情况下使基因失活。替选地，同源定向修复(HDR)途径可以使用同源模板dsDNA或ssDNA修复所述DSB，从而实现精确的基因组编辑。
[0008]最近，利用脱氨酶蛋白(诸如作用于RNA的腺苷脱氨酶，ADAR)，开发了用于RNA编辑的新工具。在哺乳动物细胞中，有三种类型的ADAR蛋白，Adar1(两个同种型，p110和p150)，Adar2和Adar3(无催化活性)。ADAR蛋白的催化底物是双链RNA，它可以从腺苷(A)核苷碱基中去除
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NH2基团，将A变为肌苷(I)，后者被识别为鸟苷(G)并且在随后的细胞转录和翻译过程中与胞苷(C)配对。研究人员将λN肽与人类Adar1或Adar2脱氨酶结构域相融合来构建λN
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ADARDD系统，该系统可由BoxB茎环和反义RNA组成的融合RNA来引导，结合特定的RNA靶标。该方法可以在靶标A碱基处将靶标A编辑为I(引入A
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C错配)，从而导致从A至G的RNA碱基编辑。用于RNA编辑的其他方法包括将反义RNA融合至R/G基序(ADAR
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募集RNA支架)以通过在哺乳动物细胞中过表达Adar1或Adar2蛋白来编辑靶标RNA，以及利用dCas13
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ADAR精确打靶和编辑RNA。
[0009]本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容均通过提及以其整体由此并入本文。
[0010]专利技术概述
[0011]核酸编辑在生物学研究和治疗学的发展中具有巨大的潜力。目前用于DNA或RNA编辑的工具依赖于将外源蛋白引入活的生物体，由于可能的异常效应子活性，传递限制和免疫原性，它们可能面临潜在的风险或技术障碍。在一些方面，本申请提供了使用短RNA来利用内源性ADAR(作用于RNA的腺苷脱氨酶)蛋白用于靶向RNA编辑的可编程方法。在一些方面，本申请提供了一种工程改造的RNA，其与靶转录物部分互补以募集天然ADAR1或ADAR2以在靶标RNA中的特定位点将腺苷变为肌苷。本文所述的方法统称为“LEAPER”(利用内源性ADAR进行RNA的可编程编辑)，而募集ADAR的RNA可互换地称为“dRNA”或“arRNA”。
[0012]在一个方面，本申请提供了一种用于编辑宿主细胞中的靶标RNA的方法，包含将脱氨酶募集RNA(dRNA)或编码脱氨酶募集RNA的构建体引入宿主细胞，其中，所述dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中，所述dRNA能够募集作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以使靶标RNA中的靶标腺苷(A)脱氨基。在某些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是小鼠细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。
[0013]在某些实施方案中，ADAR天然地或内源地存在于宿主细胞中，例如，天然地或内源地存在于真核细胞中。在一些实施方案中，ADAR由宿主细胞内源表达。在某些实施方案中，ADAR对宿主细胞而言是外源的。在一些实施方案中，ADAR由核酸(例如DNA或RNA)编码。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码ADAR的构建体引入宿主细胞。在一些实施方案中，该方法不包含将任何蛋白质引入宿主细胞中。在某些实施方案中，所述ADAR是ADAR1和/或ADAR2。在一些实施方案中，ADAR是选自由hADAR1，hADAR2，小鼠ADAR1和小鼠ADAR2构成的组的一种或多种ADAR。
[0014]在某些实施方案中，Cas不识别所述dRNA。在一些实施方案中，所述dRNA不包含CRISPR/Cas系统中使用的crRNA，tracrRNA或gRNA。在一些实施方案中，该方法不包含将Cas或Cas融合蛋白引入宿主细胞中。
[0015]在某些实施方案中，所述靶标RNA中的靶标A的脱氨基作用导致所述靶标RNA中的错义突变、过早的终止密码子、异常剪接或可变剪接。在一些实施方案中，靶标RNA编码蛋白质，而所述靶标RNA中靶标A的脱氨基作用导致所述蛋白质的点突变、截短、延伸和/或错误折叠。在一些实施方案中，所述靶标RNA中靶标A的脱氨基作用导致靶标RNA中的错义突变、过早的终止密码子、异常剪接或可变剪接的回复。在一些实施方案中，其中所述靶标RNA编码截短的、延长的、突变的或错误折叠的蛋白质，靶标RNA中的靶标A的脱氨基作用通过靶标RNA中的错义突变、过早的终止密码子、异常剪接或可变剪接的回复产生有功能的、全长的、正确折叠的和/或野生型蛋白质。在一些实施方案中，靶标RNA是调节RNA，并且靶标A的脱氨基作用导致由靶标RNA调节的下游分子的表达的变化。在某些实施方案中，该方法用于利用内源性腺苷脱氨酶在靶标RNA上的编辑产生由靶标RNA编码的蛋白质的点突变和/或错误折叠、和/或在靶标RNA中产生过早的终止密码子、异常剪接位点、和/或的可变剪接位点。
[0016]在某些实施方案中，提供了用于编辑宿主细胞中的多种靶标RNA的方法，其中所述方法包含将多种dRNA或编码所述多种dRNA的构建体引入宿主细胞中，其中所述多种脱氨酶募集RNA中的每一种包含与多种靶标RNA中的相应靶标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编辑宿主细胞中靶标RNA的方法，包含将脱氨酶募集RNA(dRNA)或编码所述dRNA的构建体引入所述宿主细胞，其中所述dRNA包含与所述靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述dRNA能够募集作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以使所述靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基。2.如权利要求1所述的方法，其中所述dRNA的长度大于70个核苷酸。3.如权利要求2所述的方法，其中所述dRNA的长度为约100至约150个核苷酸。4.如权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述ADAR由所述宿主细胞内源表达。5.如权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是原代细胞。6.如权利要求5所述的方法，其中所述宿主细胞是T细胞。7.如权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述dRNA不包含ADAR募集结构域。8.如权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述dRNA不包含化学修饰的核苷酸。9.如权利要求8所述的方法，其包括将编码所述dRNA的构建体引入所述宿主细胞，其中所述构建体是病毒载体或质粒。10.如权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中所述RNA序列包含与所述靶标RNA中的所述靶腺苷正对的胞苷、腺苷或尿苷。11.如权利要求10所述的方法，其中所述RNA序列包含与所述靶标RNA中的所述靶腺苷正对的胞苷错配。12.如权利要求11所述的方法，其中所述胞苷错配位于所述dRNA中距所述互补序列的3'端至少20个核苷酸，并且距所述互补序列的5'端至少5个核苷酸。13.如权利要求12所述的方法，其中所述胞苷错配位于所述dRNA中所述互补序列中心的10个核苷酸内。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述互补序列还包含一个或多个鸟苷，其各自与所述靶标RNA中的非靶腺苷相对。15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述互补序列包含与所述靶标RNA中的非靶腺苷相对的两个或更多个连续错配核苷酸。16.如权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中所述靶标RNA中所述靶标腺苷的5'侧最近邻位是选自U，C，A和G的核苷酸，优先度U>C≈A>G，而所述靶标RNA中所述靶标腺苷的3'侧最近邻位是选自G，C，A和U的核苷酸，优先度G>C>A≈U。17.如权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中所述靶标RNA中的所述靶标腺苷位于选自由UAG，UAC，UAA，UAU，CAG，CAC，CAA，CAU，AAG，AAC，AAA，AAU，GAG，GAC，GAA和GAU构成的组的三碱基基序中。18.如权利要求17所述的方法，其中所述三碱基基序是UAG，并且其中所述dRNA包含与所述三碱基基序中的尿苷正对的A，与所述靶标腺苷正对的胞苷，以及与所述三碱基基序中的鸟苷正对的胞苷、鸟苷或尿苷。19.如权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中所述靶标RNA是选自由前信使RNA，信使RNA，核糖体RNA，转移RNA，长非编码RNA和小RNA构成的组的RNA。20.如权利要求19所述的方法，其中所述靶标RNA是前信使RNA。21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其进一步包括将ADAR3的抑制剂引入所述宿主细胞。
22.如权利要求1
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21中任一项所述的方法，其进一步包括将干扰素的刺激物引入所述宿主细胞。23.如权利要求1
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22中任一项所述的方法，其包括引入分别靶向不同靶标RNA的多个dRNA。24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中编辑所述靶标RNA的效率为至少5％。25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述dRNA不诱导免疫应答。26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏文胜，璩良，伊宗裔，朱诗优，王春慧，曹中正，周卓，袁鹏飞，
申请(专利权)人：北京辑因医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：