一种血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法和应用。试剂盒包括磁珠、裂解液、蛋白酶K、结合液、清洗液和洗脱液。提取方法：将血浆样品、裂解液、蛋白酶K、结合液和磁珠混合，裂解后的血浆游离DNA(cfDNA)与磁珠孵育形成磁珠

【技术实现步骤摘要】
一种血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种血浆游离DNA提取试剂盒及提取方法和应用。

技术介绍

[0002]核酸是生物大分子的一种，其作为遗传信息的携带者，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。核酸对生物的生长和遗传等起决定性作用，与肿瘤的发生也有重要关系。因此，对核酸的研究是现代医学研究中的重要课题之一。
[0003]核酸在人体内通常和蛋白质结合，得到高质量的核酸是后续研究的基础，因此在提取过程中要尽量保证提取充分，并保证核酸的一级结构完整，防止蛋白质等生物大分子的污染。目前核酸的分离技术主要有：
[0004]苯酚/氯仿提取法：该方法是目前使用最广泛、最经典的核酸分离纯化技术。先将样本材料裂解，之后与酚氯仿充分混匀，利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性；十二烷基磺酸钠(SDS)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，使核蛋白变性降解，DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。通过离心后由上而下形成三层，上层为含核酸的水相层，中间为主要含蛋白质的乳化层，下层为酚氯仿有机溶剂，吸取上层水相就能将蛋白质和核酸有效地分开。但其缺点是所用试剂为有毒试剂。
[0005]盐析法：通过将组织、细胞在裂解液中裂解后，加入高盐(NaCl、NH4Cl、KCl)促使蛋白质变性形成不溶性物质而除去，从而将杂质和核酸得以分离。该法的缺点在于杂质去除不彻底。
[0006]玻璃珠法：利用玻璃珠在高离液盐(盐酸胍、NaCl、异硫氰酸胍)条件下与核酸发生吸附反应，在低离液盐条件下核酸会被洗脱下来，从而实现核酸和蛋白质、糖、脂质等杂质分离的目的。其缺点是会有玻璃珠的残留。
[0007]硅胶柱法：该方法采用特殊硅基质材料，在一定的高盐、低pH值条件下高效、专一地吸附DNA、RNA，在低盐、高pH值情况下释放DNA、RNA。离心柱上含有Resin合成树脂，具有吸附DNA的功能，从而实现核酸与蛋白质等杂质的分离。其缺点是需要较多的样本，耗材多，珍稀样本不适合通过本法提取核酸。
[0008]磁珠法：目前广泛应用于DNA的提取纯化实验。磁珠的基本结构一般分为3层，内层是聚苯乙烯，第二层包裹磁性物质四氧化三铁(Fe3O4)，最外层是官能团基团修饰的高分子材料。利用表面标记了官能团的纳米级磁珠微珠，官能团与核酸吸附，蛋白质等杂质不会与磁珠吸附，磁珠可以在磁场下聚集和分散，从而实现将核酸与杂质分离的目的。该法用到的磁珠一般为羟基磁珠，该磁珠体系包含：磁珠、聚乙二醇(PEG)和盐离子等，在一定浓度的
PEG和盐离子(如Na
+
)环境中，DNA分子的水化层脱去，DNA胶体热力学稳定性被破坏，构象也随之改变，带负电荷的磷酸基团大量暴露在外面，通过Na
+
与羟基形成“电桥”，使得DNA可吸附到羟基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体)，形成了“核酸
‑
磁珠复合物”，同时磁珠具有超顺磁性，可以通过外磁场进行吸附操作，该过程是可逆的，在适当条件下，DNA分子可以被洗脱回收。
[0009]人体血液循环系统中不断流动着血液细胞，体细胞和血细胞破裂降解后，释放胞浆中的内含物，包括蛋白质、外泌体、RNA及携带有各种遗传信息的DNA片段即cfDNA(cell free DNA)。该类DNA片段含有例如突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等异常情况，特别是来自基因组的ctDNA(circulating tumor DNA，循环肿瘤细胞DNA)片段。这种被成为液体活检，侵犯性低，可多次获得样品，以观察动态变化。在外周血中，基因异常的ctDNA只占全部DNA的极小部分，大约0.1～1％，且高度碎片化(通常为几十到一百多碱基对)，提取难度高，降低了临床检测的敏感性和特异性。目前的DNA提取方法所提取的ctDNA含量低。
[0010]目前市场上存在的试剂盒操作方便，但所提取的ctDNA含量低，提取率一般且价格昂贵。因此，需要提供一种提取效率高，性价比好的试剂盒，在提高提取效率的同时还可以减少提取成本，为研究和临床的后续应用带来方便。

技术实现思路

[0011]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种血浆游离DNA提取试剂盒，该试剂盒的提取效率高，简单快速，成本低。
[0012]本专利技术还提出一种血浆游离DNA的提取方法。
[0013]本专利技术还提出所述血浆游离DNA提取试剂盒或所述血浆游离DNA提取方法在制备血浆甲基化标志物中的应用。
[0014]根据本专利技术的一个方面，提出了一种血浆游离DNA提取试剂盒，包括磁珠、裂解液、蛋白酶K、结合液；所述裂解液包括Tris
‑
HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚山梨醇酯
‑
20(Tween20)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triron X
‑
100)。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述裂解液包括：1～2M、pH为8.0～9.0的Tris
‑
HCl，0.5～1M、pH为8.0～9.0的乙二胺四乙酸，质量浓度为1～30％的聚山梨醇酯
‑
20，质量浓度为0.1～3％的聚乙二醇辛基苯基醚，质量浓度为30～40％的无水乙醇。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述裂解液的总体积为50mL。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述磁珠用于吸附DNA，以悬浮液状态参与反应。
[0018]在本专利技术的一些实施方式中，所述磁珠包括羟基磁珠、氨基磁珠、硅胶质膜磁珠中的任一种。
[0019]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述磁珠选自所述羟基磁珠。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述磁珠以磁珠悬浮液的方式加入，体积为50～100μL。
[0021]在本专利技术的一些实施方式中，所述蛋白酶K用于降解蛋白质，灭活核酸酶(DNase和RNase)。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，所述蛋白酶K的浓度为20～21mg/mL。
[0023]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述蛋白酶K的体积为50～100μL。
[0025]在本专利技术的一些实施方式中，所述结合液包括：5～7.5M的盐酸胍或3M的异硫氰酸胍，以及质量浓度为30～45％的无水乙醇。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，所述血浆游离DNA提取试剂盒还包括清洗液和洗脱液。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，包括磁珠、裂解液、蛋白酶K、结合液；所述裂解液包括Tris
‑
HCl、乙二胺四乙酸、聚山梨醇酯
‑
20和聚乙二醇辛基苯基醚。2.根据权利要求1所述的血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括：1～2M、pH为8.0～9.0的Tris
‑
HCl，0.5～1M、pH为8.0～9.0的乙二胺四乙酸，质量浓度为1～30％的聚山梨醇酯
‑
20，质量浓度为0.1～3％的聚乙二醇辛基苯基醚，质量浓度为30～40％的无水乙醇。3.根据权利要求1所述的血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20～21mg/mL；优选地，所述磁珠选自羟基磁珠，所述磁珠以磁珠悬浮液的方式加入，体积为50～100μL；优选地，所述结合液包括：5～7.5M的盐酸胍或3M的异硫氰酸胍，以及质量浓度为30～45％的无水乙醇。4.根据权利要求1所述的血浆游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述血浆游离DNA提取试剂盒还包括清洗液和洗脱液；所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液；所述第一清洗液包括：0.1～10M的异硫氰酸胍，0.1～1M、pH为8.0～9.0的Tris
‑
HCl，10～500mM的乙二胺四乙酸，7～9M的高氯酸钠，质量浓度为20～40％的无水乙醇或异丙醇；所述第二清洗液包括：1～5000mM的Tris
‑
HCl，质量浓度为70～80％的无水乙醇；所述洗脱液包括：1～15mM的Tris
‑
HCl，1～15mM的TE缓冲液；优选地，所述洗脱液的pH为8.0～9.0。5.一种血浆游离DNA的提取方法，其特征在于，使用权利要求1～4任一项所述血浆游离DNA提取试剂盒进行提取，包括以下步骤：S1：将血浆样品与裂解液、蛋白酶K混合，得第一混合液；S2：向所述第一混合液中加入磁珠和结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡立夫，南熠郎，
申请(专利权)人：胡立夫，
类型：发明
国别省市：