一种从梅花鹿粪便中提取宿主核基因组DNA的方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从梅花鹿粪便中提取宿主核基因组DNA的方法。该方法将梅花鹿粪便样品置于无水乙醇中，然后进行离心震荡洗脱，得到洗脱液；向洗脱液中加入醋酸钠溶液，混匀，离心，得到富集的梅花鹿肠壁细胞及破碎肠壁细胞释放的宿主DNA；然后通过75％乙醇清洗，离心，干燥，得到收集物；最后使用微量DNA提取试剂盒从收集物中提取梅花鹿核基因组DNA。本发明专利技术的方法操作简单，高效可靠，耗时短，成本低，通过使用无水乙醇对梅花鹿粪便表明附着的肠壁细胞进行洗脱，显著增加了梅花鹿肠壁细胞及其DNA的收集量，同时在洗脱过程保证粪球的完整性，最大限度减少了细菌DNA对梅花鹿核基因组DNA的污染。DNA对梅花鹿核基因组DNA的污染。

【技术实现步骤摘要】
一种从梅花鹿粪便中提取宿主核基因组DNA的方法及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种从梅花鹿粪便中提取宿主核基因组DNA的方法。

技术介绍

[0002]梅花鹿(Cervusnippon)隶属于偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Cervidae)鹿属，是东亚季风区特产鹿类，国际濒危物种，我国I级保护动物。历史上，梅花鹿曾广泛分布于亚洲东北部，共记录有13个亚种。我国曾分布有6个亚种，分别为山西亚种(C.n.grassianus)、河北亚种(C.n.mandarinus)、东北亚种(C.n.hortulorm)、四川亚种(C.n.sichaunicus)、华南亚种(C.n.kopschi)和台湾亚种(C.n.taioanus)。其中山西亚种、河北亚种和台湾亚种的野外种群已经灭绝，我国目前仅存东北亚种、四川亚种和华南亚种3个亚种，总数量1000余只，且零散分布于我国四川、江西、浙江等省的狭窄区域，分布区相互隔离。在种群数量上，除四川铁布保护区和江西桃红岭保护区的种群外，其它种群均低于理论最小种群数500只，依然面临种群灭绝风险。因此，开展野生梅花鹿种群保护遗传学研究，对于掌握其种群遗传结构和遗传变异水平，从而制定精确有效的保护管理措施，确保其种群健康快速发展具有重要意义。目前国内对于梅花鹿种群遗传多样性的研究几乎只限于东北亚种的人工饲养种群，野生梅花鹿种群由于血液、肌肉等组织样品采集困难，其保护遗传学研究难以全面深入开展。
[0003]近年来，非损伤性取样因为可以在不伤害野生动物的情况下获取分析所需的DNA，因此在野生动物保护遗传学、分子生态学和分子进化等领域获得了广泛应用。其是指在不捕获、触及，甚至在未见到动物的情况下，收集动物毛发、粪便、尿液、脱落羽毛、含口腔脱落细胞的食物残渣、鳞片以及卵壳等样品，从中获取动物DNA的方法。有研究表明，每克哺乳动物粪便中含有1
×
105～1
×
106个宿主肠壁细胞，且大部分肠壁细胞依然保持完整，因此粪便是在不损伤野生哺乳动物条件下获取其遗传物质的有效途径。但动物粪便样品的成分相较于血液和组织样品复杂的多，其包含了大量的食物残渣和细菌，宿主脱落的肠壁细胞只占其中极其微小的一部分。所以直接从粪便中提取的DNA只含有极少量的宿主DNA，而且其中包含了多种PCR反应抑制物质，因此难以直接应用于宿主的遗传学分析。
[0004]为提升从粪便中获取的宿主DNA数量，目前开发了多种从粪便中富集宿主DNA的方法，包括DNA甲基化免疫共沉淀、介电泳分离、免疫磁珠分选等商业化粪便DNA提取技术、商品化粪便DNA提取试剂盒和通用的哺乳动物粪便DNA提取方法等。DNA甲基化免疫共沉淀等商业化粪便DNA提取技术虽然能从粪便样品中富集高纯度的宿主基因组DNA，但对样品新鲜度要求严格、步骤繁琐且价格昂贵，单个样品的费用高达几百元，因此难以大范围应用推广。商品化粪便DNA提取试剂盒是目前应用最多的粪便DNA提取手段，其对宿主线粒体DNA的提取效果较好，而且价格相对便宜，单个样品费用约50元，但是对宿主核基因组DNA的提取效果欠佳。哺乳动物粪便DNA提取方法是针对上述方法的缺点提出的通用方法，其主要是利用SDS、十六烷基三甲基溴化铵、TNE缓冲液等不同裂解液对粪便样品进行预处理，裂解粪便中的宿主肠壁细胞，释放DNA，然后离心取上清液进行宿主DNA的提取。这类方法价格相对低
廉，适用性广，与商品化粪便DNA提取试剂盒相比，在一定程度上提升了宿主核基因组DNA的提取量，但由于细胞裂解液在裂解宿主肠壁细胞的同时会裂解大量细菌，特别是对粪便进行破碎或研磨处理后进一步增加了细菌的裂解量，导致提取的宿主DNA中包含大量细菌DNA，对后续遗传分析造成了很大干扰。因此开发一种价格便宜，操作简单、高效可靠提取宿主核基因组DNA的方法是至关重要的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是解决现有技术的不足，提供一种从梅花鹿粪便中高效提取宿主核基因组DNA的方法，具体采用以下的技术方案：
[0006]一种从梅花鹿粪便中高效提取宿主核基因组DNA的方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1：将梅花鹿粪便样品置于无水乙醇中，然后进行离心震荡洗脱20s～40s，得到洗脱液；
[0008]步骤2：向洗脱液中加入浓度为3M
‑
5M的醋酸钠溶液，洗脱液和醋酸钠溶液的体积比为1mL：0.05mL
‑
0.1mL，混匀，离心，得到富集的梅花鹿肠壁细胞及破碎肠壁细胞释放的宿主DNA；
[0009]步骤3：向富集的梅花鹿肠壁细胞及破碎肠壁细胞释放的宿主DNA加入75％乙醇清洗，离心，干燥，得到收集物；
[0010]步骤4：使用微量DNA提取试剂盒从收集物中提取梅花鹿核基因组DNA。
[0011]本专利技术对梅花鹿肠壁细胞及其释放DNA的富集仅使用了无水乙醇和醋酸钠两种试剂，通过使用无水乙醇对梅花鹿粪便表明附着的肠壁细胞及破碎肠壁细胞释放的DNA进行洗脱防止DNA溶解，避免了常用缓冲液中溶剂均为水，在洗脱过程中均会溶解DNA，会显著影响DNA的收集量。同时，使用醋酸钠是因为醋酸钠中的Na
+
可平衡DNA链上的PO4‑
，有利于宿主DNA的聚集，显著增加了梅花鹿肠壁细胞及其DNA的收集量，进一步在洗脱过程保证粪球的完整性，最大限度减少了细菌DNA对梅花鹿核基因组DNA的污染，显著提升了所提取梅花鹿核基因组DNA的浓度和纯度，可有效应用于SRY、ZFX、MHC等核基因和微卫星序列的扩增及分析。本专利技术对梅花鹿样品的要求宽松，对新鲜及长时间保存的粪便样品均有较好的提取效果，同时操作简单，耗时短，高效可靠，与现有商业化提取方法和试剂盒单个样品费用相比，大大降低了DNA提取成本。在此基础上，由于上一步富集物中残留的醋酸盐会影响后续操作，通过使用75％乙醇清洗，利用其中的水分可溶解残留的醋酸盐，而乙醇又可限制DNA溶于水。此外，本专利技术的方法还可以应用在草食性哺乳动物粪便提取宿主细胞核基因组DNA中。
[0012]上述方法中梅花鹿粪便样品可以为经过长时间保存的干燥的梅花鹿粪便，也可以为新鲜湿润的梅花鹿粪便。上述新鲜湿润的梅花鹿粪便烘干的温度为25℃～30℃，烘干的时间为10min～20min。
[0013]作为进一步优选的实施方式，上述微量DNA提取试剂盒组分包括BufferGL、Proteinas eK和RNaseA；上述BufferGL、ProteinaseK和RNaseA的用量比例为180μL：20μL：10μL。
[0014]作为进一步优选的实施方式，上述步骤1中梅花鹿粪便样品和无水乙醇的用量比例为1g：2mL。如果无水乙醇加入量过大，后续需要多次离心收集洗脱物，会增加实验步骤及
时间，如果无水乙醇加入量过少，会导致洗脱不充分，进而减少宿主肠壁细胞及DNA的洗脱量。
[0015]作为进一步优选的实施方式，上述醋酸钠溶液的浓度为5M；上述洗脱液和醋酸钠溶液的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从梅花鹿粪便中提取宿主核基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将梅花鹿粪便样品置于无水乙醇中，然后进行离心震荡洗脱20s～40s，得到洗脱液；步骤2：向洗脱液中加入浓度为3M
‑
5M的醋酸钠溶液，洗脱液和醋酸钠溶液的体积比为1mL：0.05mL
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0.1mL，混匀，离心，得到富集的梅花鹿肠壁细胞及破碎肠壁细胞释放的宿主DNA；步骤3：向富集的梅花鹿肠壁细胞及破碎肠壁细胞释放的宿主DNA加入75％乙醇清洗，离心，干燥，得到收集物；步骤4：使用微量DNA提取试剂盒从收集物中提取梅花鹿核基因组DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微量DNA提取试剂盒组分包括BufferGL、ProteinaseK和RNaseA。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，BufferGL、ProteinaseK和RNaseA的用量比例为18...

【专利技术属性】
技术研发人员：张阳，黄晓凤，韩卫杰，张天祥，张曼玉，
申请(专利权)人：江西省林业科学院，
类型：发明
国别省市：