一种高质量样品前处理试剂及其方法技术

本发明专利技术提供了一种生物样DNA保存试剂和保存方法。所述保护试剂蛋白变性剂、缓冲剂、表面活性剂、螯合剂和核酸保护剂。所述保存方法通过将唾液样品保存在所述保护试剂中从而对唾液样品中的DNA进行保护。本发明专利技术可以实现唾液样品的DNA在环境条件下的稳定运输和保存，尤其适合于传染性样品的安全运输；在提取纯化后能够以高得量获得高质量的DNA，能够确保唾液中DNA在保存过程中的完整性；可快速灭活唾液样品中的病原体微生物，抑制各种病毒或细菌生长，杜绝二次传染；可以避免对唾液样品造成过度稀释。度稀释。度稀释。

【技术实现步骤摘要】
一种高质量样品前处理试剂及其方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及唾液样品的保存和核酸提取方法。

技术介绍

[0002]目前分子生物学中，基于核酸扩增的分子技术已日益用于法医、军事、人类医药以及科学研究等方面。如在法医鉴定方面，通过提取家属的DNA以进行核酸扩增可对死者的身份进行辨认；又如在人类健康方面，通过对检测者的血液、其他体液或细胞中的DNA进行检测，并进行核酸扩增，收集其相关基因信息后，分析其所含有的各种基因情况，使人们了解自己的基因信息，预知身体患病的风险，从而通过改善自己的生活环境，养成良好生活习惯等方式，避免或延缓疾病的发生。
[0003]一般用于提取基因组DNA的体液通常来自静脉血液(主要提取其中的白细胞)，但使用血液作为检测来源具有很多缺点。首先，血液的采集需要经过训练的专业人员操作；其次，血液采集是侵入性方式，经常给供试者带来一定程度的不适和疼痛；此外，血液采集过程还需要避免一些血源性病原体造成的感染。
[0004]从唾液中提取DNA的方式相对于传统的从血液中提取DNA的方式来说，具有如下优点。首先，采集过程简单方便，无需经专业训练的人员即可操作。其次，这种方式为非侵入式采集方式，可避免对受检者造成不必要的不适和疼痛。再其次，更为关键的是，唾液样品往往可以由受试者自己采集，然后通过相应的保存技术运输至实验室进行核酸检验。
[0005]但是，在唾液保存过程中，需要维持DNA的完整性，抑制核酸酶对DNA的降解作用，以及防止细菌、真菌等微生物对DNA纯度的污染。因此如何使唾液在长时间保存下还能通过核酸提取过程获得纯度较高且质量较好的DNA，成为唾液样品是否可以取代血液样品成为基因检测的关键所在。
[0006]中国专利CN102919218B公开了一种人体唾液保存用组合物及其制备方法，其组分和含量如下：pH为6
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8.5的Tris
‑
HCl 5
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20mmol/L，EDTA0.5
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2mmol/L，NaOAc 2.5
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3.5mol/L，蔗糖0.1
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0.4mol/L，N
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乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺1
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3mmol/L，对羟基苯甲酸丙酯1
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4mg/mL，重氮烷基咪唑脲1
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3mg/mL，蛋白酶K10μ0/mL，体系pH7.5
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8.5。该样品保存液可以与唾液1∶1体积保存唾液中的DNA，且可以在室温下保存4个月左右，高温(40度)保存7天以上。该方案中用到蛋白酶K，蛋白酶K的室温活性会不可避免地逐渐降低，导致本身样品保存液的保质期较短，长期保存DNA的能力也是会受到很大的影响，此外，该方案未能系统研究唾液样品保存与下游核酸提取之间的关系。
[0007]中国专利CN105695447公开了一种用于保存唾液中DNA的组合物，包括变性剂、缓冲液、螯合剂、氯化钠和聚乙二醇。该专利的专利技术人认为该方案通过荧光定量PCR稳定检出保存15个月的唾液DNA，但我们从实施例中看到经过保存的唾液样品，提取到大部分DNA的A260/280纯度都小于1.7，质量较差，且普遍浓度较低。
[0008]中国专利CN108220281A公开一种含有结合核酸的磁珠在生物样品保存液的制备和运用，较为系统性地考虑了唾液样品保存和核酸提取之间的关系，但该保存液得到的DNA
浓度较低，且保存液含有蛋白酶K，不可避免地会有和中国专利CN102919218B方案一样的缺陷。
[0009]此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本专利技术时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本专利技术不具备这些现有技术的特征，相反本专利技术已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在
技术介绍
中增加相关现有技术之权利。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是提供一种针对唾液样品的高质量样品前处理试剂(本文有时简称为“保存试剂”)其处理方法(本文有时称为“保存方法”)。
[0011]为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术在第一方面提供了一种生物样品DNA保存试剂，所述保存试剂包含蛋白变性剂、缓冲剂、表面活性剂、螯合剂、核酸保护剂和溶剂；其中，所述蛋白变性剂为高氯酸钠。
[0012]在一些优选的实施方式中，所述溶剂为水或水性缓冲液。
[0013]在另一些优选的实施方式中，所述生物样品DNA保存试剂包含：质量体积百分比为30
‑
50％(例如为40％)的高氯酸钠、终浓度为10
‑
500mM(例如为20、50、100或200mM)的缓冲剂、质量体积百分比为1
‑
20％(例如为2、5、10或15％)的表面活性剂、终浓度为1
‑
200mM(例如为10、100或150mM)的螯合剂和质量体积百分比为0.05
‑
5％(例如为0.1、1或2％)的核酸保护剂。
[0014]在一些优选的实施方式中，所述生物样品DNA保存试剂的pH为5.5
‑
10.5(例如为8.0、8.5或9.0)。优选的，所述生物样品DNA保存试剂的pH为8.0
‑
9.5。
[0015]在一些优选的实施方式中，所述缓冲剂为三羟基氨基甲烷、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、乙磺酸钠、乙酸钠、柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾、硼酸、硼酸钠、磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢铵、二乙醇胺、丙磺酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、乙酸铵、亮氨酸、N，N
‑
二羟乙基甘氨酸、3
‑
(环己胺)
‑1‑
丙磺酸、3
‑
吗啉丙磺酸、酒石酸钠、酒石酸中的一种或任意几种的组合。
[0016]在一些更优选的实施方式中，所述缓冲液为乙磺酸钠、柠檬酸、硼酸钠、N，N
‑
二羟乙基甘氨酸、3
‑
(环己胺)
‑1‑
丙磺酸、酒石酸钠、酒石酸中的一种或任意几种的组合。
[0017]在一些更优选的实施方式中，所述缓冲剂为柠檬酸、硼酸钠、乙酸铵和酒石酸钠中的一种或任意几种的组合，并且所述缓冲剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：20
‑
400mM(例如50、100或200mM)的柠檬酸、20
‑
200mM(例如50或100mM)的硼酸钠、50
‑
500mM(例如100、200、300或400mM)的乙酸铵、10
‑
200mM(例如20、50、100或150mM)的酒石酸钠。
[0018]在一些更优选的实施方式中，所述缓冲剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：20
‑
200mM(例如50或100mM))的硼酸钠、50
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物样品DNA保存试剂，其特征在于，所述保存试剂包含蛋白变性剂、缓冲剂、表面活性剂、螯合剂、核酸保护剂和溶剂；其中，所述的蛋白变性剂为高氯酸钠。2.根据权利要求1所述的保存试剂，其特征在于，所述保存试剂包含：质量体积百分比为30
‑
50％的高氯酸钠、终浓度为10
‑
500mM的缓冲剂、质量体积百分比为1
‑
20％的表面活性剂、终浓度为1
‑
200mM的螯合剂和质量体积百分比为0.05
‑
5％的核酸保护剂。3.根据权利要求1或2所述的保存试剂，其特征在于：所述保存试剂的pH为5.5
‑
10.5；优选的是，所述保存试剂的pH为8.0
‑
9.5；另外优选的是，所述溶剂为水或水性缓冲液。4.根据权利要求1至3中任一项所述的保存试剂，其特征在于：所述缓冲剂为三羟基氨基甲烷、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、乙磺酸钠、乙酸钠、柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾、硼酸、硼酸钠、磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢铵、二乙醇胺、丙磺酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、乙酸铵、亮氨酸、N,N
‑
二羟乙基甘氨酸、3
‑
(环己胺)
‑1‑
丙磺酸、3
‑
吗啉丙磺酸、酒石酸钠、酒石酸中的一种或任意几种的组合；优选的是，所述缓冲剂为乙磺酸钠、柠檬酸、硼酸钠、乙酸铵、N,N
‑
二羟乙基甘氨酸、3
‑
(环己胺)
‑1‑
丙磺酸、酒石酸钠、酒石酸中的一种或任意几种的组合；更优选的是，所述缓冲剂为柠檬酸、硼酸钠、乙酸铵和酒石酸钠中的一种或任意几种的组合，并且所述缓冲剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：20
‑
400mM的柠檬酸、20
‑
200mM的硼酸钠、50
‑
500mM的乙酸铵、10
‑
200mM的酒石酸钠；进一步优选的是，所述缓冲剂在存在的情况下在所述保存试剂中的浓度如下：20
‑
200mM的硼酸钠、50
‑
500mM的乙酸铵、10
‑
200mM的酒石酸钠。5.根据权利要求1至4中任一项所述的保存试剂，其特征在于：所述表面活性剂为阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和/或两性表面活性剂；优选的是，所述表面活性剂选自Brij 35、Brij 56、Brij 58、十二烷基硫酸钠、NP40、聚乙二醇辛基苯基醚、胆酸钠、脱氧胆酸钠、Span
‑
80、Span
‑
20、Span
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40、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、高分子阳离子烷基多糖苷、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、松香基季铵盐阳离子表面活性剂、乙撑基双(十六酰胺丙基二甲基溴化铵)、十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、十二醇聚氧乙烯醚基二甲基十二烷基溴化铵和椰油基葡萄糖苷羟丙基三甲基氯化铵中的一种或任意几种的组合；更优选的是，所述表面活性剂为十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵的一种或任意几种的组合；进一步优选的是，所述保存试剂包含十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵作为表面活性剂，并且该表面活性剂在所述保存试剂中的质量体积百分比为1
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20％的十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵；更进一步优选的是，所述十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵和十二醇聚氧乙烯醚基二甲基十二烷基溴化铵中所聚合的氧乙烯醚基重复单元的数量各自独立地为8至20，例
如为10至12。6.根据权利要求1至5中任一项所述的保存试剂，其特征在于：所述螯合剂为乙二胺四乙酸、次氮基三乙酸、水杨酸、三草酸、二亚乙基三胺五乙酸、柠檬酸、柠檬酸钠、N,N'
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乙二胺二琥珀酸、邻菲咯啉、酒石酸钾钠、柠檬酸铵、酒石酸、酒石酸钠、三乙醇胺中的一种或任意几种的组合；优选的是...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹永龙，张佳斌，何宗顺，田付友，曲峰，
申请(专利权)人：苏州白垩纪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：