一种DNA直接扩增试剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种DNA直接扩增试剂及其应用。具体地说，本发明专利技术提供了一种核酸释放剂，包含多铵、N,N

【技术实现步骤摘要】
一种DNA直接扩增试剂及其应用


[0001]本专利技术涉从粗样本直接扩增核酸，尤其涉及从多种样本中直接扩增DNA的试剂及其应用。

技术介绍

[0002]分子直扩又称Direct PCR技术或免提取扩增技术，它能够将原始未经DNA提取与纯化的样本直接加入PCR反应体系并获得扩增产物，减少检验步骤，降低检验成本，是PCR技术的一种。在该项技术出现之前，样品的预处理是科研人员难以避免并头疼的一项工作，动植物组织样本的研磨、核酸的提取与纯化步骤多、时间长，不仅容易造成样本的交叉污染、降解，还会增加实验的试剂、仪器和时间成本。
[0003]对于生物样本快速高效检验而言，分子直扩无疑是一个巨大的革命性进步。然而，实际应用过程中发现，采用传统的直接扩增试剂并不能得到理想的实验结果。其主要的原因是生物样本通常伴随着大量的PCR抑制剂释放至PCR体系中，使DNA聚合酶活性降低或者失活，从而严重降低PCR效率甚至导致假阴性结果的产生。研究人员建立通过添加不同PCR增强剂或使用具有抗抑制能力的聚合酶配合多种不同直接扩增试剂体系，很多商业化直接扩增试剂也先后被推出并应用于实践。随着技术的不断演进和发展，分子直扩已经实现了第一代PCR的直接扩增，但是对基于第二代荧光定量PCR的直扩技术还未有深入研究和突破。
[0004]中国专利CN 112662779 A公开了一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的引物组、试剂盒及其方法，虽然流程已经减少，但是依然需要对组织样本进行蛋白酶K消化和过柱纯化等步骤。
[0005]中国专利CN113444771A公开了一种适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂、试剂盒及其在病毒PCR检测中的应用，其本质是专利技术了一种对于病毒样本的裂解试剂，只能处理拭子、病毒培养物等较为简单的样本，且其裂解剂组分主要为Tris
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HCl、离液盐、表面活性剂、还原剂、EDTA及RNA酶抑制剂Rnasin，我们清楚地知道商品化qPCR Mix大都不能耐受离液盐、还原剂和EDTA，因此其专利技术的裂解剂应用领域将非常受限。
[0006]综上所述，虽然现有技术中不能提供完整的方案或方法能解决多种类型样本(血液、唾液、拭子、动物组织和植物组织等)的基于第二代荧光定量PCR的DNA直接扩增的问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种可以对多样本中的DNA进行荧光定量PCR的直接扩增技术。本专利技术的方案包含一种针对多种生物类型样本的核酸释放剂和2X Direct qPCR Master Mix。
[0008]本专利技术在第一方面提供了一种核酸释放剂，所述核酸释放剂可以快速释放多种生物类型样本中的DNA且去除绝大部分PCR抑制剂。
[0009]具体地说，本专利技术的核酸释放剂包含：多铵、还原剂、N,N
‑
二甲基甲酰胺、酒石酸、
十二烷基二苯醚二磺酸钠、Brij 30和水。
[0010]优选的是，所述核酸释放剂包含：10
‑
200mM多铵、1
‑
10mM还原剂、1
‑
20％N,N
‑
二甲基甲酰胺、0.1
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10mM酒石酸、0.01
‑
0.5％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、0.01
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5％Brij 30和余量的水。
[0011]优选的是，所述核酸释放剂包含：20
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100mM多铵、2
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5mM还原剂、2
‑
10％N,N
‑
二甲基甲酰胺、0.2
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5mM酒石酸、0.02
‑
0.2％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、0.05
‑
2％的Brij 30和余量的水。
[0012]更优选的是，所述核酸释放剂包含：50mM多铵、2mM还原剂、5％N,N
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二甲基甲酰胺、1mM酒石酸、0.15％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、1.5％的Brij 30和余量的水。
[0013]优选的是，所述核酸释放剂的pH为10.0
‑
13.5，优选为10.5
‑
12.5，更优选为12.0。
[0014]优选的是，所述多铵为三亚乙基四胺或二亚乙基三胺和/或其组合。
[0015]优选的是，所述还原剂为二硫苏糖醇、TCEP
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HCl(三(2
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羧乙基)膦盐酸盐)、巯基乙醇、半胱氨酸、维生素C、连二亚硫酸盐、巯基乙酸和/或其组合。
[0016]在本专利技术的核酸释放剂中，所述多铵提供了一种较强的碱性环境，在阴离子表面活性剂十二烷基二苯醚二磺酸钠和非离子表面活性剂Brij 30(CAS：9002
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92
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0)的作用下，可以快速裂解细胞释放DNA，并且多铵可以快速结合细胞中的蛋白杂质，如血红蛋白、抗体等，使其不会抑制DNA聚合酶的活性。
[0017]所述N,N
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二甲基甲酰胺增加了细胞的通透性，可以使多铵和表面活性剂快速裂解细胞成为可能。
[0018]所述的酒石酸可以螯合金属离子，抑制细胞裂解后释放的核酸酶活性，以减少DNA的降解。
[0019]所述还原剂可以破坏细核酸酶的二硫键，减弱其活性，与酒石酸配合可以抑制超过90％的DNA酶的活性。
[0020]优选的是，所述还原剂和酒石酸的组合可以抑制超过99％的DNA酶的活性。
[0021]所述十二烷基二苯醚二磺酸钠是一种高性能的阴离子表面活性剂，在强碱溶液中表现出非常好的稳定性，可以在室温下裂解细胞，并变性蛋白质，令人意料不到的是，在弱碱性条件下，十二烷基二苯醚二磺酸钠与Brij30相互作用能快速裂解细胞，释放DNA至溶液中。
[0022]所述Brij 30是一种非离子表面活性剂，可以与十二烷基二苯醚二磺酸钠配合在弱碱性下快速裂解细胞释放核酸，并且Brij 30是一种对PCR影响较小的非离子表面活性剂，不会对下游扩增反应产生影响。
[0023]在一些更具体的实施方式中，本专利技术公开了一种可以快速释放多种生物类型样本中的DNA且去除绝大部分抑制剂的核酸释放剂，所述的核酸释放剂由以下组成：50mM多铵、2mM还原剂、5％N,N
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二甲基甲酰胺、1mM酒石酸、0.15％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、1.5％Brij 30，余量的水，样本释放剂的pH为12.0。
[0024]所述的多铵为三亚乙基四胺或二亚乙基三胺和/或其组合。
[0025]所述还原剂为二硫苏糖醇、TCEP
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HCl(三(2
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羧乙基)膦盐酸盐)和/或其组合。
[0026]本专利技术在第二方面提供了一种可以使用上述粗样本的直接扩增试剂，其中所述直接扩增试剂(2X Direct qPCR Master Mix)包含：Tris
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HCl，硫酸铵，dNTPs，BSA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂包含：多铵、还原剂、N,N
‑
二甲基甲酰胺、酒石酸、十二烷基二苯醚二磺酸钠、Brij 30和水。2.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于：所述核酸释放剂包含：10
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200mM多铵、1
‑
10mM还原剂、1
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20％N,N
‑
二甲基甲酰胺、0.1
‑
10mM酒石酸、0.01
‑
0.5％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、0.01
‑
5％Brij 30和余量的水；优选的是，所述核酸释放剂的pH为10.0
‑
13.5；另外优选的是，所述核酸释放剂包含：20
‑
100mM多铵、2
‑
5mM还原剂、2
‑
10％N,N
‑
二甲基甲酰胺、0.2
‑
5mM酒石酸、0.02
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0.2％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、0.05
‑
2％的Brij 30和余量的水；更优选的是，所述核酸释放剂的pH为10.5
‑
12.5；另外优选的是，所述核酸释放剂包含：50mM多铵、2mM还原剂、5％N,N
‑
二甲基甲酰胺、1mM酒石酸、0.15％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、1.5％的Brij 30和余量的水；更优选的是，所述核酸释放剂的pH为12.0。3.根据权利要求1或2所述的核酸释放剂，其特征在于：所述多铵为三亚乙基四胺或二亚乙基三胺和/或其组合；和/或所述还原剂为二硫苏糖醇、TCEP
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HCl(三(2
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羧乙基)膦盐酸盐)、巯基乙醇、半胱氨酸、维生素C、连二亚硫酸盐、巯基乙酸和/或其组合。4.一种直接扩增试剂，其特征在于，所述直接扩增试剂包含：Tris
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HCl，硫酸铵，dNTPs，BSA，MgCl2，耐受型热启动DNA聚合酶和聚(4
‑
苯乙烯磺酸
‑
共聚
‑
马来酸)钠盐。5.根据权利要求4所述直接扩增试剂，其特征在于：所述直接扩增试剂包含：10
‑
200mM Tris
‑
HCl，10
‑
100mM硫酸铵，100
‑
500μM的dNTPs，100
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800μg/mL的BSA，1
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10mM的MgCl2，1
‑
5U的耐受型热启动DNA聚合酶和0.1
‑
10mM的聚(4
‑
苯乙烯磺酸
‑
共聚
‑
马来酸)钠盐；优选的是，所述直接扩增试剂包含如下物质：20
‑
100mM Tris
‑
HCl，20
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80mM硫酸铵，200
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400μM的dNTPs，200
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【专利技术属性】
技术研发人员：邹永龙，何宗顺，曲峰，张佳斌，
申请(专利权)人：苏州白垩纪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：