拭子DNA直接扩增试剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及拭子DNA直接扩增试剂及其应用。具体地说，本发明专利技术提供了一种DNA处理液，包含三亚乙基四胺、N,N

【技术实现步骤摘要】
拭子DNA直接扩增试剂及其应用


[0001]本专利技术涉从粗样本直接扩增核酸，尤其涉及拭子样本中的DNA进行荧光定量PCR的直接扩增技术。

技术介绍

[0002]在生物样品如口腔拭子中的核酸检测，通常需要在实施PCR之前从所述样品提取和纯化核酸，这是因为生物样品中的细胞例如口腔细胞中的蛋白、杂质能够干扰PCR扩增。从生物样品提取核酸耗费时间，并涉及污染的高风险，考虑到分离和检测生物样品中的核酸分子涉及的高度的复杂性，日益期望不用任何上游核酸提取或大量的预处理步骤，直接检测生物样品中的核酸，这项技术被称为分子直扩技术。
[0003]分子直扩又称Direct PCR技术或免提取扩增技术，它能够将原始未经DNA提取与纯化的样本直接加入PCR反应体系并获得扩增产物，减少检验步骤，降低检验成本，是PCR技术的一种。在该项技术出现之前，样品的预处理是科研人员难以避免并头疼的一项工作，动植物组织样本的研磨、核酸的提取与纯化步骤多、时间长，不仅容易造成样本的交叉污染、降解，还会增加实验的试剂、仪器和时间成本。
[0004]对于生物样本快速高效检验而言，分子直扩无疑是一个巨大的革命性进步。然而，实际应用过程中发现，采用传统的直接扩增试剂并不能得到理想的实验结果。其主要的原因是生物样本通常包含随后被释放至PCR体系中的大量的PCR抑制剂，这些抑制剂使DNA聚合酶活性降低或者失活，从而严重降低PCR效率甚至导致假阴性结果的产生。研究人员建立通过添加不同PCR增强剂或使用具有抗抑制能力的聚合酶配合多种不同直接扩增试剂体系，很多商业化直接扩增试剂也先后被推出并应用于实践。随着技术的不断演进和发展，分子直扩已经实现了第一代PCR的直接扩增，但是对基于第二代荧光定量PCR的直扩技术还未有深入研究和突破。
[0005]中国专利CN112662779A公开了一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的引物组、试剂盒及其方法，虽然流程已经减少，但是依然需要对组织样本进行蛋白酶K消化和过柱纯化等步骤。
[0006]中国专利CN111500735A公开了一种免提取直接扩增及检测高发肿瘤易感基因多态性的引物组和探针、试剂盒及其方法。其提到可以对于新鲜刮取细胞的口腔拭子重悬于无菌水即可进行检测。但是这种方式只能适用于现场检测，若进行远途的运输等，拭子中微生物的生长和其中DNA的降解将大大降低检出的灵敏度。
[0007]综上所述，现有技术中还没有提供对于生物样品例如口腔拭子中DNA进行直接荧光定量PCR检测分析。本专利技术提供了一种快速、便捷的针对口腔拭子DNA直接荧光定量PCR检测的技术方案，同时还能保证拭子中的DNA不降解，无需人员现场去进行采样，可以通过快递运输等直接送至医院或者检验室进行分析即可。
[0008]此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本专利技术时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝
非本专利技术不具备这些现有技术的特征，相反本专利技术已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在
技术介绍
中增加相关现有技术之权利。

技术实现思路

[0009]为了解决上述的一个或多个技术问题，本专利技术在第一方面提供了一种DNA处理液，所述处理液包含：三亚乙基四胺、N，N
‑
二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二亚乙基三胺五乙酸、还原剂、Gemini表面活性剂和水。
[0010]本专利技术在第二方面提供了一种在环境稳定下保护拭子样本中DNA的方法，所述方法将含有生物样品的拭子样本保存在本专利技术第一方面所述的处理液中。
[0011]本专利技术在第三方面提供了一种直接扩增试剂，所述直接扩增试剂包含：Tris
‑
HCl，硫酸铵，Brij35，dNTPs，BSA，MgCl2，耐受型热启动DNA聚合酶和环糊精。
[0012]本专利技术在第四方面提供了一种对拭子样本的粗DNA进行分析的方法，其中，所述拭子样本保存在本专利技术第一方面所述的处理液中；和/或所述分析采用本专利技术第三方面所述的直接扩增试剂进行扩增来进行。
[0013]相对于现有技术，本专利技术的DNA处理液能够在环境条件下长时间保持DNA的完整性，所述直接扩增试剂具有强抗干扰性，且能够以高灵敏度进行检测分析。
附图说明
[0014]图1是本专利技术实施例2中受试者1号DNA粗样本和提取DNA产物的扩增曲线，1：通过制备例2提供的直接扩增试剂对提取DNA产物的扩增曲线；2：通过制备例2提供的直接扩增试剂对DNA粗样本的扩增曲线；3：通过对比例4提供的直接扩增试剂对提取DNA产物的扩增曲线；4：通过对比例4提供的直接扩增试剂对DNA粗样本的扩增曲线。
[0015]图2是实施例3中10和受试者的拭子样本在DNA处理液中保存第0天与第90天后提取DNA产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
[0016]本专利技术的主要目的是提供一种可以对拭子中的DNA进行荧光定量PCR的直接扩增技术，本专利技术的技术方案包括一种针对拭子样本的DNA处理液和直接扩增试剂(2X Direct qPCR Master Mix)。
[0017]本专利技术在第一方面提供了一种DNA处理液，所述处理液可以快速裂解拭子中的细胞、释放DNA，且结合大部分PCR抑制剂，同时可以在室温下保存DNA不被降解。该DNA处理液结合“裂解”、“释放”和“保存”三个功能。
[0018]具体地说，本专利技术的DNA处理液包含：三亚乙基四胺、N,N
‑
二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二亚乙基三胺五乙酸、还原剂、Gemini表面活性剂和水。
[0019]优选的是，所述DNA处理液包含：10
‑
200mM(例如为20、50、100或150mM)三亚乙基四胺、1
‑
20％(例如2、5、1O或15％)N,N
‑
二甲基甲酰胺、5
‑
50％(10、20、30或40％)二甲基亚砜、1
‑
10mM(例如2、5或8mM)二亚乙基三胺五乙酸、1
‑
10mM(例如2、5或8mM)还原剂、0.01
‑
1％(例如0.1或0.5％)Gemini表面活性剂和余量的水。
[0020]其中，所述的1
‑
20％N,N
‑
二甲基甲酰胺、5
‑
50％二甲基亚砜和0.01
‑
1％Gemini表
面活性中的1
‑
20％和5
‑
50％和0.01
‑
1％指的是质量体积比，下同。
[0021]优选的是，所述DNA处理液包含：20
‑
100mM三亚乙基四胺、2
‑
10％N,N
‑
二甲基甲酰胺、10
‑
40％二甲基亚砜、1
‑
5mM二亚乙基三胺五乙酸、1
‑
5mM还原剂、0.02
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA处理液，其特征在于，所述处理液包含：三亚乙基四胺、N,N
‑
二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二亚乙基三胺五乙酸、还原剂、Gemini表面活性剂和水。2.根据权利要求1所述的处理液，其特征在于：所述处理液包含：10
‑
200mM三亚乙基四胺、1
‑
20％N,N
‑
二甲基甲酰胺、5
‑
50％二甲基亚砜、1
‑
10mM二亚乙基三胺五乙酸、1
‑
10mM还原剂、0.01
‑
1％Gemini表面活性剂和余量的水，其中百分比以质量体积比计；优选的是，所述处理液包含：20
‑
100mM三亚乙基四胺、2
‑
10％N,N
‑
二甲基甲酰胺、10
‑
40％二甲基亚砜、1
‑
5mM二亚乙基三胺五乙酸、1
‑
5mM还原剂、0.02
‑
0.5％的Gemini表面活性剂和余量的水，其中百分比以质量体积比计；更优选的是，所述处理液包含：20mM三亚乙基四胺、5％N,N
‑
二甲基甲酰胺、20％二甲基亚砜、2.5mM二亚乙基三胺五乙酸、1mM TCEP
‑
HCl、0.25％的辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵和余量的水，其中百分比以质量体积比计。3.根据权利要求1至3中任一项所述的处理液，其特征在于，所述处理液的pH为6.0
‑
12.5，优选为7.5
‑
11.5，更优选为8.0
‑
9.5。4.根据权利要求1至4中任一项所述的处理液，其特征在于：所述还原剂为二硫苏糖醇、三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐、巯基乙醇、半胱氨酸、维生素C、连二亚硫酸盐、巯基乙酸中的一种或多种的组合；优选的是，所述还原剂为二硫苏糖醇、三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐和巯基乙酸和/或其组合；和/或所述Gemini表面活性剂选自十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、十六醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵、辛烷基聚氧乙烯基十二烷基氯化铵、乙撑基双(十六酰胺丙基二甲基溴化铵)、十二醇聚氧乙烯醚二甲基辛烷基氯化铵、十二醇聚氧乙烯醚基二甲基十二烷基溴化铵中的一种或任意几种的组合；优选的是，所述的Gemini表面活性剂为辛烷基聚氧乙烯基十四烷基氯化铵。5.一种在环境条件下保护拭子样本中DNA的方法，其特征在于，所述方法将含有生物样品的拭子样本保存在权利要求1至4中任一项所述的处理液中；优选的是，所述拭子为植绒拭子；更优选的是，一支拭子样本加入0.2
‑
3mL优选0.4
‑
1mL的所述处理液。6.一种直接扩增试剂，其特征在于，所述直接扩增试剂包含：Tris
‑
HCl，硫酸铵，Brij35，dNTPs，BSA，MgCl2，耐受型热启动DNA聚合酶和环糊精。7.根据权利要求6所述的直接扩增试剂，其特征在于：所述直接扩增试剂包含：10
‑
200mM Tris

【专利技术属性】
技术研发人员：邹永龙，张佳斌，何宗顺，田付友，曲峰，
申请(专利权)人：苏州白垩纪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：