【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于单细胞分析的cDNA加标对照
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35 U.S.C.
§
119(e)要求2020年7月13日提交的美国临时专利申请系列第63/051,149号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
[0003]背景
[0004]领域
[0005]本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如使用分子条形码化(molecular barcoding)确定基因表达。
[0006]对相关技术的描述
[0007]当前的技术允许在每个细胞与条形码化试剂珠在隔室(compartment)中共定位时通过将细胞特异性寡核苷酸条形码附接至来自个体细胞的多(A)mRNA分子而以大规模并行的方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达。对于用于确定测定工作流程失败的存在的组合物、方法和系统(包括确定对核酸靶的拷贝进行条形码化的失败和确定测序文库产生的失败)存在需求。另外地，对于用于确定测序文库成员的测序状态(例如，饱和测序或测序不足(under s...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于对样品中的核酸靶进行标记的方法，包括：将核酸靶的拷贝用第一多于一个寡核苷酸条形码条形码化以产生多于一个条形码化核酸分子，所述多于一个条形码化核酸分子各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列；提供多于一个一种或更多种条形码化对照核酸，其中所述一种或更多种条形码化对照核酸的每一种的拷贝数是预定的；产生包含多于一个核酸靶文库成员和多于一个对照核酸文库成员的测序文库，其中产生测序文库包括：将测序衔接子附接至所述多于一个条形码化核酸分子或其产物，以产生所述多于一个核酸靶文库成员；以及将测序衔接子附接至所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸或其产物，以产生所述多于一个对照核酸文库成员；以及获得包含一个或更多个核酸靶文库成员的多于一个测序读段和一个或更多个对照核酸文库成员的多于一个测序读段的测序数据。2.根据权利要求1所述的方法，其中将核酸靶的拷贝用所述第一多于一个寡核苷酸条形码条形码化包括：使所述核酸靶的拷贝与所述第一多于一个寡核苷酸条形码接触，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码的每一个寡核苷酸条形码包含第一通用序列、分子标记和能够与所述核酸靶杂交的靶结合区；以及使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述第一多于一个寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化核酸分子，所述多于一个条形码化核酸分子各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列。3.根据权利要求1
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2中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码化核酸分子的每一个条形码化核酸分子包含第一通用序列和分子标记。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述样品包括单细胞。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中所述样品包括多于一个单细胞，所述方法包括：在使所述核酸靶的拷贝与所述第一多于一个寡核苷酸条形码接触之前，将所述多于一个单细胞分区至多于一个分区，其中所述多于一个分区中的分区包括来自所述多于一个单细胞的单细胞；以及在包含单细胞的分区中，使所述核酸靶的拷贝与所述第一多于一个寡核苷酸条形码接触。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分区是孔或液滴。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码与第一固体支持物关联，所述方法包括将所述第一固体支持物与所述样品中的所述单细胞关联，并且其中所述多于一个分区中的分区包括单个第一固体支持物。8.根据权利要求7所述的方法，包括在所述分区步骤之后且在所述接触步骤之前裂解所述单细胞，任选地裂解所述单细胞包括加热所述样品、使所述样品与去污剂接触、改变所述样品的pH或其任何组合。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中所述多于一个一种或更多种条形码化
对照核酸通过以下方式产生：使预定拷贝数的一种或更多种对照核酸与第二多于一个寡核苷酸条形码接触，其中所述第二多于一个寡核苷酸条形码的每一个寡核苷酸条形码包含第一通用序列、对照标记和能够与所述一种或更多种对照核酸杂交的靶结合区；以及使与所述一种或更多种对照核酸杂交的第二多于一个标记的寡核苷酸延伸，以产生预定拷贝数的一种或更多种条形码化对照核酸，所述一种或更多种条形码化对照核酸各自包含与所述一种或更多种条形码化对照核酸的至少一部分互补的序列。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中所述第二多于一个寡核苷酸条形码与第二固体支持物关联和/或所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸与第二固体支持物关联。11.根据权利要求2
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10中任一项所述的方法，其中使所述第一多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第二多于一个寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5
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至3
’
外切核酸酶活性和3
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至5
’
外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使所述第一多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第二多于一个寡核苷酸条形码延伸，任选地所述DNA聚合酶包括Klenow片段。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，任选地所述病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。13.根据权利要求1
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12中任一项所述的方法，其中所述条形码化对照核酸的每一种包含第一通用序列、对照标记和靶结合区中的一种或更多种。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中所述第二多于一个寡核苷酸条形码的每一种对照标记包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种条形码化对照核酸：(i)包括两种或更多种不同条形码化对照核酸；(ii)与至少约2种、3种、4种、6种、8种、10种、12种、15种、20种、25种、30种、35种或40种不同的核酸靶至少约70％同源；和/或(iii)包括至少约2种、3种、4种、6种、8种、10种、12种、15种、20种、25种、30种、35种或40种不同的条形码化对照核酸。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中一种或更多种条形码化对照核酸：(i)与核酸靶至少约70％同源；(ii)包含持家基因的序列；(iii)与所述样品的基因组序列同源；(iv)与所述样品的基因组序列不同源；和/或(v)与物种的基因组序列同源，任选地所述物种是非哺乳动物物种，还任选地所述非哺乳动物物种是噬菌体物种，任选地所述噬菌体物种是T7噬菌体、PhiX噬菌体或其任何组合。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中产生测序文库包括：使随机引物与所述多于一个条形码化核酸分子和所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸接触，其中所述随机引物的每一个包含第二通用序列或其互补物；使与所述多于一个条形码化核酸分子杂交的所述随机引物延伸以产生第一多于一个
延伸产物；以及使与所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸分子杂交的所述随机引物延伸以产生第二多于一个延伸产物。18.根据权利要求17所述的方法，所述方法包括：使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述第一多于一个延伸产物，从而产生第一多于一个条形码化扩增子；以及使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述第二多于一个延伸产物，从而产生第二多于一个条形码化扩增子，其中所述多于一个核酸靶文库成员包括所述第一多于一个条形码化扩增子或其产物，并且其中所述多于一个对照核酸文库成员包括所述第二多于一个条形码化扩增子或其产物。19.根据权利要求18所述的方法，其中扩增所述第一多于一个延伸产物和所述第二多于一个延伸产物包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加至所述第一多于一个延伸产物和所述第二多于一个延伸产物。20.根据权利要求18
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19中任一项所述的方法，包括基于与所述第一多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。21.根据权利要求18
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20中任一项所述的方法，其中产生测序文库包括：使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述第一多于一个条形码化扩增子，从而产生第三多于一个条形码化扩增子；以及使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述第二多于一个条形码化扩增子，从而产生第四多于一个条形码化扩增子，其中所述多于一个核酸靶文库成员包括所述第三多于一个条形码化扩增子或其产物，并且其中所述多于一个对照核酸文库成员包括所述第四多于一个条形码化扩增子或其产物。22.根据权利要求21所述的方法，其中扩增所述第一多于一个条形码化扩增子和所述第二多于一个条形码化扩增子包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加至所述第一多于一个条形码化扩增子和所述第二多于一个条形码化扩增子。23.根据权利要求21
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22中任一项所述的方法，包括基于与所述第三多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。24.根据权利要求18
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23中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个条形码化扩增子和/或所述第三多于一个条形码化扩增子包含全转录组扩增(WTA)产物。25.根据权利要求1
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24中任一项所述的方法，其中产生测序文库包括：
使用所述多于一个条形码化核酸分子作为模板合成第五多于一个条形码化扩增子以产生第五多于一个条形码化扩增子；以及使用所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸作为模板合成第六多于一个条形码化扩增子，以产生第六多于一个条形码化扩增子，其中所述多于一个核酸靶文库成员包括所述第五多于一个条形码化扩增子或其产物，并且其中所述多于一个对照核酸文库成员包括所述第六多于一个条形码化扩增子或其产物。26.根据权利要求25所述的方法，其中合成所述第五多于一个条形码化扩增子和所述第六多于一个条形码化扩增子包括使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和靶特异性引物进行的PCR扩增。27.根据权利要求25
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26中任一项所述的方法，其中合成所述第五多于一个条形码化扩增子和所述第六多于一个条形码化扩增子包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加至条形码化核酸分子和条形码化对照核酸。28.根据权利要求25
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27中任一项所述的方法，包括基于与所述第五多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定所述样品中所述核酸靶的拷贝数。29.根据权利要求1
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28中任一项所述的方法，其中将核酸靶的拷贝用所述第一多于一个寡核苷酸条形码条形码化包括：使多于一个核酸靶的拷贝与所述第一多于一个寡核苷酸条形码接触，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码的每一个寡核苷酸条形码包含第一通用序列、分子标记和能够与所述核酸靶的拷贝杂交的靶结合区；以及产生各自包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补物的多于一个条形码化核酸分子。30.根据权利要求29所述的方法，其中产生各自包含所述靶结合区和所述靶结合区的互补物的多于一个条形码化核酸分子包括：在存在逆转录酶和包含所述靶结合区或其一部分的模板转换寡核苷酸的情况下，使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述第一多于一个寡核苷酸条形码延伸，以产生多于一个条形码化核酸分子，所述多于一个条形码化核酸分子各自包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列、第一分子标记、所述靶结合区和所述靶结合区的互补物。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述逆转录酶具有末端转移酶活性，任选地所述逆转录酶是病毒逆转录酶，任选地鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。32.根据权利要求30
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31中任一项所述的方法，其中所述模板转换寡核苷酸包含一个或更多个3
’
核糖核苷酸，并且任选地三个3
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核糖核苷酸，还任选地所述3
’
核糖核苷酸包含鸟嘌呤。33.根据权利要求29
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32中任一项所述的方法，其中产生测序文库包括：使每一个条形码化核酸分子的所述靶结合区的互补物与以下中的一种或更多种的靶结合区杂交：(i)所述第一多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码，(ii)所述条形码化核酸分子自身，以及
(iii)所述多于一个条形码化核酸分子中的不同条形码化核酸分子；使所述多于一个条形码化核酸分子的3
’
末端延伸以产生各自包含所述第一分子标记和第二分子标记的多于一个延伸的条形码化核酸分子。34.根据权利要求33所述的方法，其中使条形码化核酸分子的靶结合区的互补物与所述第一多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的靶结合区杂交包括使条形码化核酸分子的靶结合区的互补物与所述第一多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的靶结合区进行分子间杂交；并且还包括：使与所述条形码化核酸分子的靶结合区的互补物杂交的寡核苷酸条形码的3
’
末端延伸，以产生多于一个延伸的条形码化核酸分子，所述多于一个延伸的条形码化核酸分子各自包含以下的互补物：第一分子标记，和第二分子标记，其中所述第二分子标记的序列不同于所述第一分子标记的序列，其中所述第二分子标记不是所述第一分子标记的互补物。35.根据权利要求1
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34中任一项所述的方法，其中所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸各自包含5
’
第一通用序列和3
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所述第一通用序列的互补物。36.根据权利要求1
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35中任一项所述的方法，其中所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸包含5
’
对照标记和3
’
所述对照标记的互补物。37.根据权利要求35
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36中任一项所述的方法，所述方法包括：使用能够与所述第一通用序列和/或其互补物杂交的引物扩增所述多于一个延伸的条形码化核酸分子，从而产生第七多于一个条形码化扩增子；以及使用能够与所述第一通用序列和/或其互补物杂交的引物扩增所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸，从而产生第八多于一个条形码化扩增子，其中所述多于一个核酸靶文库成员包括所述第七多于一个条形码化扩增子或其产物，并且其中所述多于一个对照核酸文库成员包括所述第八多于一个条形码化扩增子或其产物。38.根据权利要求37所述的方法，其中扩增所述多于一个延伸的条形码化核酸分子和扩增所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加至所述多于一个延伸的条形码化核酸分子和所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸。39.根据权利要求37
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38中任一项所述的方法，包括基于与所述第七多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、具有不同序列的第二分子标记或其组合的数目来确定所述样品中所述多于一个核酸靶的每一个的拷贝数。40.根据权利要求35
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39中任一项所述的方法，包括：使用能够与所述核酸靶的序列杂交的靶特异性引物和能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述多于一个延伸的条形码化核酸分子，从而产生第九多于一个条形码化扩增子；以及使用能够与所述核酸靶的序列杂交的靶特异性引物和能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物扩增所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸，从而产生第十多于一个条形码化扩增子，其中所述多于一个核酸靶文库成员包括所述第九多于一个条形码化扩增子或其产物，并且其中所述多于一个对照核酸文库成员包括所述第十多于一个条形码化扩增子或其产
物。41.根据权利要求40所述的方法，其中扩增所述多于一个延伸的条形码化核酸分子和扩增所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加至所述多于一个延伸的条形码化核酸分子和所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸。42.根据权利要求40
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41中任一项所述的方法，包括基于与所述第九多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的第一分子标记、具有不同序列的第二分子标记或其组合的数目来确定所述样品中所述多于一个核酸靶的每一个的拷贝数。43.根据权利要求1
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42中任一项所述的方法，其中所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸各自包含靶结合区和所述靶结合区的互补物，并且其中产生测序文库包括：使每一个条形码化对照核酸的所述靶结合区的互补物与以下中的一种或更多种的靶结合区杂交：(i)所述第二多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码，(ii)所述条形码化对照核酸本身，以及(iii)所述多于一个一种或更多种条形码化对照核酸的不同条形码化对照核酸；以及使所述多于一个条形码化对照核酸的3
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末端延伸以产生多于一个延伸的条形码化对照核酸，所述多于一个延伸的条形码化对照核酸各自包含第一通用序列、所述第一通用序列的互补物、对照标记和所述对照标记的互补物。44.根据权利要求43所述的方法，其中使条形码化对照核酸的靶结合区的互补物与所述第二多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的靶结合区杂交包括使条形码化对照核酸的靶结合区的互补物与所述第二多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的靶结合区进行分子间杂交；并且还包括：使与所述条形码化对照核酸的靶结合区的互补物杂交的寡核苷酸条形码的3
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末端延伸，以产生多于一个延伸的条形码化对照核酸。45.根据权利要求43
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44中任一项所述的方法，包括：使用能够与所述第一通用序列和/或其互补物杂交的引物扩增所述多于一个延伸的条形码化核酸分子，从而产生第十一多于一个条形码化扩增子；以及使用能够与所述第一通用序列和/或其互补物杂交的引物扩增所述多于一个延伸的条形码化对照核酸，从而产生第十二...
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