冻干保护剂及其在制备PCR冻干试剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物技术领域，尤其涉及冻干保护剂及其在制备PCR冻干试剂中的应用。本发明专利技术提供的含有糖类和叔丁醇的冻干保护剂组合，能够使PCR冻干试剂在普通低湿环境中减少含水量，提高耐湿性。利用本发明专利技术所述制备方法获得的冻干微球硬度高、不易掉屑，有利于人工和自动化分装。和自动化分装。

【技术实现步骤摘要】
冻干保护剂及其在制备PCR冻干试剂中的应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，尤其涉及冻干保护剂及其在制备PCR冻干试剂中的应用。

技术介绍

[0002]现在分子诊断试剂大多数为液体试剂，具有灵敏度高、同时检测多靶标等优点，但液体试剂中酶等物质需要在
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20℃保存，使用时需反复冻融，影响试剂的稳定性。为保持试剂良好的性能标准及摆脱冷链运输，降低成本，研究人员提出了冷冻干燥技术。现冷冻干燥技术可以使试剂以固态形式在室温下保存，具体是将混合物中已经冻结的固态冰不经融化成液态水的过程而直接升华成气态，最终去除水分并保留其他有效组分的新式高效干燥技术。
[0003]冷冻干燥技术在分子诊断试剂应用广泛，有原位冻干试剂，即将添加冻干保护剂的PCR试剂分装于八连排管内，然后放入冻干机进行冻干，具有计量精确、4度运输、便于保存等优点，但因受管材的影响，形状不规则，只能小批量生产，需预冻3
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4个小时，冻干工艺时间长，实验操作转移困难。另外一种是非原位冻干试剂即冻干微球，PCR试剂液氮预冻成球，转移至西林瓶后，转移至真空干燥箱半压盖进行冷冻干燥，在冻干完成后，利用冻干机板层的升降来进行压盖，完成初步密封，随后出仓转移到低湿环境内进行二次密封。因冻干产品一般含水量在3％～5％之内，极低的含水量加上冻干制品海绵状的结构特性，使其在出箱过程中特别容易吸潮，吸潮后对产品稳定性和保质期都有非常大的影响。
[0004]常见的冻干保护剂包括糖类、多聚物、BSA等组合，选择一种不易使冻干制品受潮的冻干保护剂对于后期产品质量稳定非常重要。通常使用可以显著升高制品玻璃化转变温度的保护剂来提高冻干品稳定性，使冻干品不易受潮，但实际应用过程中发现当使用这些冻干剂组合后，在常规RH30％相对湿度环境下，冻干品仍容易受潮不稳定，同时加入量过大时，则会导致冻干品强度变差，在后期分装过程中，容易掉屑，继而导致试剂量减少，性能不稳定，因此现阶段仍需开发出一种不易使冻干产品受潮、不易掉屑且稳定性高的冻干保护剂组合。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种冻干保护剂及其在制备PCR冻干试剂中的应用。本专利技术提供的含有糖类和叔丁醇的冻干保护剂组合使PCR冻干试剂耐湿性好且稳定，不易掉屑。
[0006]本专利技术提供了一种冻干保护剂组合，包括乳糖、菊糖、甘露醇、PEG20000、PVP、水解明胶、叔丁醇、十二烷基聚乙二醇醚和消泡剂；
[0007]其中各组分的质量比为(0.03～0.25)：(0.02～0.07)：(0.01～0.15)：(0.005～0.05)：(0.002～0.05)：(0.001～0.01)：(0.001～0.02)：(0.001～0.01)：(0.001～0.005)。
[0008]具体的，在一些实施例中，所述乳糖、菊糖、甘露醇、PEG20000、PVP、水解明胶、叔丁
醇、十二烷基聚乙二醇醚和消泡剂的质量比为0.03:0.03:0.02:0.01:0.005:0.005:0.005:0.005:0.002。
[0009]在一些具体实施例中，消泡剂为SE
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15。
[0010]本专利技术提供的冻干保护剂组合中的叔丁醇能够与水任意混溶，在冷冻时形成的针状结构，升华后会形成疏松骨架结构和管状通道，能够使冻干微球保持良好的外观且不易掉屑，以及含水量减少。在本专利技术具体的实施例中，添加本专利技术所述冻干保护剂组合的冻干微球在普通低湿环境下(相对湿度30％)暴露不同时间后均比添加其他保护剂组合的冻干微球含水量少、大小和性能无变化且分装后没有发生掉屑现象。
[0011]本专利技术提供了所述冻干保护剂在制备PCR冻干试剂中的应用。
[0012]本专利技术提供了一种PCR冻干试剂，其包括PCR扩增试剂和本专利技术所述的冻干保护剂。
[0013]进一步的，所述PCR扩增试剂中各组分的浓度为：
[0014]20mmol/L～200mmol/L缓冲体系、10mmol/L～100mmol/L阳离子、30μmol/L～400μmol/L脱氧核糖核苷酸、0.5U/μL～10U/μL DNA聚合酶或等温扩增酶、0.5U/μL～5U/μL逆转录酶、0.3μmol/L～1.0μmol/L上下游引物和0.15μmol/L～0.5μmol/L探针；
[0015]作为优选，缓冲体系的浓度为：100mmol/L，阳离子的浓度为：50mmol/L，脱氧核糖核苷酸的浓度为：200μmol/L，DNA聚合酶或等温扩增酶的浓度为：1U/μL，逆转录酶的浓度为：1U/μL，上下游引物的浓度为：0.8μmol/L，探针的浓度为：0.4μmol/L。
[0016]更进一步的，所述PCR冻干试剂中，所述冻干保护剂的质量分数为10wt％～30wt％；
[0017]作为优选，冻干保护剂的质量分数为11.2wt％。
[0018]本专利技术提供的PCR冻干试剂中，所述缓冲体系包括Tris
‑
HCl、HEPES、Tricine中的至少一种；
[0019]所述阳离子包括K
+
、Mg
2+
、Mn
2+
中的至少一种；
[0020]所述DNA聚合酶或等温扩增酶包括Taq聚合酶、Pfu聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Phi29聚合酶中的至少一种；
[0021]所述逆转录酶包括MMLV逆转录酶、T7逆转录酶中的至少一种。
[0022]具体的，在本专利技术的实施例中，所述PCR冻干试剂中的组分包括：
[0023]Tricine 100mmol/L、Mg
2+
50mmol/L、dNTP 200μmol/L、Taq聚合酶1U/μL、MMLV逆转录酶1U/μL、上游引物0.4μmol/L、下游引物0.4μmol/L、探针0.2μmol/L，以及冻干保护剂11.2wt％。
[0024]本专利技术还提供了所述PCR冻干试剂的制备方法，包括将配制好的PCR试剂经液氮预冻后，进行真空冷冻干燥，获得PCR冻干试剂。
[0025]具体的，在本专利技术的实施例中，液氮预冻的具体步骤为：将配制的PCR试剂灌装入点珠机中，调节分装体积及分装速率后滴入液氮中，将预冻的微球迅速转移到预冻的西林瓶中，半压盖后转移至预冻的真空冷冻干燥机中，转移过程中，保证冻干微球始终在液氮中；液氮预冻主要是防止冻干微球在常温下融化成液体。
[0026]冷冻干燥包括升华干燥和解析干燥两个步骤，具体为：
[0027](1)升华干燥：第一阶段设定预冷冻温度为
‑
60
±
2℃，持续时间120～360min，第二
阶段设定为0.5
±
0.1℃/分钟的升温，升温至
‑
40
±
2℃，达到温度后自动进入第三阶段；第三阶段设定温度为
‑
40
±
2℃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.冻干保护剂，其特征在于，其包括乳糖、菊糖、甘露醇、PEG20000、PVP、水解明胶、叔丁醇、十二烷基聚乙二醇醚和消泡剂；其中各组分的质量比为(0.03～0.25)：(0.02～0.07)：(0.01～0.15)：(0.005～0.05)：(0.002～0.05)：(0.001～0.01)：(0.001～0.02)：(0.001～0.01)：(0.001～0.005)。2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述乳糖、菊糖、甘露醇、PEG20000、PVP、水解明胶、叔丁醇、十二烷基聚乙二醇醚和消泡剂的质量比为0.03:0.03:0.02:0.01:0.005:0.005:0.005:0.005:0.002。3.权利要求1或2所述的冻干保护剂在制备PCR冻干试剂中的应用。4.PCR冻干试剂，其特征在于，其包括PCR扩增试剂和权利要求1或2所述的冻干保护剂；所述PCR扩增试剂中各组分的浓度为：20mmol/L～200mmol/L缓冲体系、10mmol/L～100mmol/L阳离子、30μmol/L～400μmol/L脱氧核糖核苷酸、0.5U/μL～10U/μL DNA聚合酶或等温扩增酶、0.5U/μL～5U/μL逆转录酶、0.3μmol/L～1.0μmol/L上下游引物和0.15μmol/L～0.5μmol/L探针。5.根据权利要求4所述的PCR冻干试剂，其特征在于，所述PCR冻干试剂中，所述冻干保护剂的质量分数为10wt％～30wt％。6.根据权利要求4所述的P...

【专利技术属性】
技术研发人员：张会敏，崔奇新，高利飞，付光宇，郑业焕，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：