一种马铃薯总RNA快速提取方法与马铃薯病毒RT-PCR检测方法技术

本发明专利技术涉及一种马铃薯总RNA快速提取方法与马铃薯病毒RT

【技术实现步骤摘要】
一种马铃薯总RNA快速提取方法与马铃薯病毒RT
‑
PCR检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，尤其涉及一种马铃薯总RNA快速提取方法与马铃薯病毒RT
‑
PCR检测方法。

技术介绍

[0002]目前植物总RNA的提取方法包括异硫氰酸胍法、CTAB法、氯化锂法以及各种商品化的试剂盒等。但这些方法均需要低温高速离心机等专业仪器以及氯仿、酚、巯基乙醇等有毒有害试剂，同时需要多次转移液体，提取操作时间一般在1h左右。因此对实验室与人员的专业性提出了较高的要求，限制了分子检测等技术的推广。

技术实现思路

[0003]为解决现有植物总RNA提取方法难以推广的问题，本专利技术提供了一种马铃薯总RNA快速提取方法与马铃薯病毒RT
‑
PCR检测方法。
[0004]本专利技术的技术方案：
[0005]一种马铃薯总RNA快速提取方法，所述提取方法采用RNA提取试纸条进行提取，具体提取步骤如下：
[0006]步骤1、将马铃薯组织与裂解液充分混合并研磨，得到组织匀浆；
[0007]步骤2、将RNA提取试纸条的核酸结合区浸入步骤1所得组织匀浆中，使组织匀浆充分浸润所述RNA提取试纸条的核酸结合区；
[0008]步骤3、将步骤2浸过组织匀浆的RNA提取试纸条的核酸结合区浸入清洗液中清洗；
[0009]步骤4、将步骤3清洗过的RNA提取试纸条的核酸结合区浸入RNase
‑
free H2O中，浸泡3min，所得浸泡液即为马铃薯总RNA样品。
[0010]进一步的，所述RNA提取试纸条的材质为慢速定性滤纸，所述RNA提取试纸条的两端分别为核酸结合区和蜡封的手柄区，所述核酸结合区和蜡封的手柄区的长度比为1:10。
[0011]进一步的，所述RNA提取试纸条的制备方法包括除酶处理和蜡封处理，所述除酶处理是将慢速定性滤纸置于0.1％的DEPC水溶液中浸泡过夜，取出后121℃15min高压灭菌后烘干处理；所述蜡封处理是将除酶处理所得慢速定性滤纸分别裁剪为50mm宽的滤纸条A和60mm宽的滤纸条B，将滤纸条A完全进入融化的石蜡中，取出冷却，然后用两张滤纸条B夹住冷却后的滤纸条A并通过热塑机，得到带有10mm宽未蜡封的核酸结合区的滤纸条B，按成品尺寸规格裁剪即得到RNA提取试纸条。
[0012]进一步的，步骤1所述裂解液为商用trizol试剂，生产方为赛默飞世尔，货号为15596026。
[0013]进一步的，步骤1中马铃薯组织与裂解液的质量体积比为10～20mg:300μL，裂解时间为10～20min。
[0014]进一步的，步骤3中所述清洗液为RNase
‑
free H2O配制的75％乙醇溶液。
[0015]进一步的，步骤3中清洗的具体方法为：将步骤2中浸过裂解缓冲液的RNA提取试纸条的核酸结合区浸入1mL清洗液中，浸泡5min，晃动清洗1～2秒取出，再次浸入到1mL新的清洗液中，浸泡1min，晃动清洗1～2秒取出，轻甩或晾干至无明显液滴。
[0016]一种马铃薯病毒RT
‑
PCR检测方法，采用本专利技术提供的马铃薯总RNA快速提取方法得到马铃薯总RNA样品，以马铃薯总RNA样品为模板获得样品的cDNA，再以样品的cDNA为模板，以单一马铃薯病毒引物对进行PCR反应或以多种马铃薯病毒引物对进行多重PCR反应，将所得PCR反应液进行琼脂糖电泳鉴定。
[0017]进一步的，所述以马铃薯总RNA样品为模板获得样品的cDNA的具体方法为：吸取16μL马铃薯总RNA样品，加入4μL 5
×
RT MIX，充分混合后37℃孵育15min，85℃孵育1min，获得样品cDNA。
[0018]进一步的，以样品的cDNA为模板进行PCR扩增的方法为：吸取1～2μL样品cDNA，加入12.5μL 2
×
PCR MIX，加入上下游引物终浓度至0.2μM，ddH2O补足至25μL，即为PCR反应液；将PCR反应液放入PCR仪中，PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性20s，54.5℃退火20s，72℃延伸20s，30次循环，72℃终延伸5min；
[0019]所述上下游引物包括如下引物：
[0020]马铃薯Y病毒：PVY
‑
2F：CCAACCCTTAGGCAAATCA；
[0021]PVY
‑
2R：CGTGATGTGACCTCATAAAAGT；
[0022]马铃薯M病毒：PVM
‑
1F：TCGGCGACCCCATACAAT；
[0023]PVM
‑
1R：CAGGTCTGCCTTTTCACTTC；
[0024]马铃薯A病毒：PVA
‑
2F：CAGGTATGGTCTTCAACGCA；
[0025]PVA
‑
2R：TTCCGTCCAGTCCAAACA；
[0026]马铃薯X病毒：PVX
‑
2F：CAAGCAAAAGATGAGACCCT；
[0027]PVX
‑
2R：TTGTGAGAAGGGAATACGC；
[0028]马铃薯S病毒：XPVS
‑
2F：CAGGGGATAAGCAAAGGTAGGC；
[0029]XPVS
‑
2R：GCCAGACCCAGATTACCAAAGAAA；
[0030]马铃薯纺锤块茎类病毒：PSTVd
‑
2F：GGGAAACCTGGAGCGAACT；
[0031]PSTVd
‑
2R：TAGTAGCYGAAGCGACAGC；
[0032]马铃薯卷叶病毒：PLRV_F：CCACTCCAACTCCCCAGAAG；
[0033]PLRV_R：TACATAGGGACGGCTTGCAT；
[0034]内参基因：EF1α
‑
3F：TCAAGTATGCSTGGGTKC；
[0035]EF1α
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3R：TCAATAATSAGGACAGCACAG。
[0036]本专利技术的有益效果：
[0037]本专利技术提供的马铃薯总RNA快速提取方法降低了对低温离心机等设备和氯仿等有毒试剂的依赖性，降低了提取操作的难度，同时缩短了提取操作时间，减低了RNA提取的技术门槛，达到操作简便、易于推广的同时又不会降低RNA的质量与浓度。依据本专利技术建立的马铃薯总RNA快速提取方法建立了检测马铃薯病毒的RT
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PCR方法，新设计的引物PCR反应程序更快捷，加快了马铃薯病毒检测的进程。
[0038]本专利技术马铃薯总RNA快速提取方法和马铃薯病毒RT
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PCR检测方法适用于实验室监测、生产田间监测、抗病毒材料的鉴定、筛选及植物检验检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯总RNA快速提取方法，其特征在于，所述提取方法采用RNA提取试纸条进行提取，具体提取步骤如下：步骤1、将马铃薯组织与裂解液充分混合并研磨，得到组织匀浆；步骤2、将RNA提取试纸条的核酸结合区浸入步骤1所得组织匀浆中，使组织匀浆充分浸润所述RNA提取试纸条的核酸结合区；步骤3、将步骤2浸过组织匀浆的RNA提取试纸条的核酸结合区浸入清洗液中清洗；步骤4、将步骤3清洗过的RNA提取试纸条的核酸结合区浸入RNase
‑
free H2O中，浸泡3min，所得浸泡液即为马铃薯总RNA样品。2.根据权利要求1所述一种马铃薯总RNA快速提取方法，其特征在于，所述RNA提取试纸条的材质为慢速定性滤纸，所述RNA提取试纸条的两端分别为核酸结合区和蜡封的手柄区，所述核酸结合区和蜡封的手柄区的长度比为1:10。3.根据权利要求1或2所述一种马铃薯总RNA快速提取方法，其特征在于，所述RNA提取试纸条的制备方法包括除酶处理和蜡封处理，所述除酶处理是将慢速定性滤纸置于0.1％的DEPC水溶液中浸泡过夜，取出后121℃15min高压灭菌后烘干处理；所述蜡封处理是将除酶处理所得慢速定性滤纸分别裁剪为50mm宽的滤纸条A和60mm宽的滤纸条B，将滤纸条A完全进入融化的石蜡中，取出冷却，然后用两张滤纸条B夹住冷却后的滤纸条A并通过热塑机，得到带有10mm宽未蜡封的核酸结合区的滤纸条B，按成品尺寸规格裁剪即得到RNA提取试纸条。4.根据权利要求3所述一种马铃薯总RNA快速提取方法，其特征在于，步骤1所述裂解液为商用trizol试剂。5.根据权利要求4所述一种马铃薯总RNA快速提取方法，其特征在于，步骤1中马铃薯组织与裂解液的质量体积比为10～20mg:300μL，裂解时间为10～20min。6.根据权利要求5所述一种马铃薯总RNA快速提取方法，其特征在于，步骤3中所述清洗液为RNase
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free H2O配制的75％乙醇溶液。7.根据权利要求6所述一种马铃薯总RNA快速提取方法，其特征在于，步骤3中清洗的具体方法为：将步骤2中浸过裂解缓冲液的RNA提取试纸条的核酸结合区浸入1mL清洗液中，浸泡5min，晃动清洗1～2秒取出，再次浸入到1mL新的清洗液中，浸泡1min，晃动清洗1～2秒取出，轻甩或晾干至无明显液滴。8.一种马铃薯病毒RT
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PCR检测方法，其特征在于，采用权利要求1
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7任一所述的马铃薯总RNA快速提取方法得到马铃薯总RNA样品，以马铃薯总RNA样品为模板获得样品的cDNA，再以样品的cDNA为模板，以单一马铃薯病毒引物对进行PCR反应或以多种马铃薯病毒引物对进行多重PCR反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：白艳菊，王腾，马爽，张威，刘尚武，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：