本发明专利技术涉及mRNA poly(A)尾的切割方法和分析方法，尤其在分段poly(A)尾的切割方法的应用，所述方法在poly(A)尾附近设计特异性DNA引物，使用RNase H酶切割特性性引物与mRNA的结合物，RNase H反应缓冲液中添加酶抑制剂，所述切割方法能分离获得完整的分段poly(A)尾，而其他酶切法可能会将分段poly(A)尾之间的非A碱基切断。而且，本申请所述方法，还降低了酶用量和反应时间，成本小，操作简单。操作简单。
【技术实现步骤摘要】
一种mRNA的poly A尾长度的分析方法
[0001]本专利技术属于生物技术研究领域，具体是涉及一种基于RNase H酶的mRNA的poly A尾长度的分析方法。
技术介绍
[0002]大多数真核生物的mRNA3
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末端都有由几十个到几百个不等的A碱基组成的Poly(A)尾巴。它们对于mRNA的稳定性和蛋白翻译非常重要，一些常见生理生化途径可能都会受到Poly(A)长度的调控作用。真核mRNA添加poly(A)尾是一个默认的过程，几乎所有的真核生物mRNA都通过转录后修饰，共获得约250
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300个A碱基的Poly(A)尾巴。但随后Poly(A)的长度在细胞核和细胞质中受到了高度调节，不同长度的Poly(A)尾有助于调节成熟mRNA的稳定性、运输和翻译。一旦mRNA到达细胞质，Poly(A)尾巴与5
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帽协同作用，与翻译起始因子4F(eIF4F)复合物形成稳定的闭环结构，促进翻译起始。Poly(A)尾的长度决定了mRNA翻译的程度，Poly(A)尾的缩短和延长可以很好地反映Poly(A)尾巴在时间和空间上对基因表达的调控。
[0003]所以了解poly(A)的尾巴长度和mRNA的稳定性和蛋白的表达之间的关系尤为重要，需要方法准确表征。目前最常用的Poly(A)序列长度为连续的120nt，但是过长的Poly(A)尾会对质粒的克隆和扩增造成麻烦。近期的研究者发现Poly(A)序列间隔开来，可以显著减少质粒DNA扩增时的重组事件，维持Poly(A)尾长，同时不影响体外体外转录生成mRNA的翻译效率和半衰期。分段Poly(A)尾是在编码基因的下游构建了一系列分段Poly(A)的质粒，分段之间由不同长度的间隔元件spacer(非A碱基)分开。分段Poly(A)的方法能降低质粒在大肠杆菌中的重组率，防止Poly(A)尾的截短，且分段构建的Poly(A)能够提高mRNA稳定性和表达量。但由于分段Poly(A)尾之间含有非A碱基，此时使用RNase A酶或RNase T1酶对mRNA进行切割截短就很可能会将分段Poly(A)尾切断，就不能检测到完整的分段Poly(A)尾。因此需要寻找一种可将分段Poly(A)尾从mRNA中完整分离的方法。
[0004]本专利技术首次创造性地将基于RNase H酶的分析方法应用于mRNA连续和分段式poly(A)尾长度分析中。
技术实现思路
[0005]基于此，本专利技术的目的是在于提供一种可以适应于mRNA的poly(A)尾长度分析方法，通过该方法，可以实现将poly(A)尾从mRNA中切割出来，不但可以针对连续Poly(A)尾长度分析，更可以针对分段Poly(A)尾长度分析，且酶用量，反应时间短。
[0006]本专利技术的第一方面，是提供了一种新的mRNA的poly(A)切割方法，包括以下步骤：包括以下步骤：
[0007]S1设计引物：针对具有待分析的poly(A)尾的mRNA，获得检测DNA引物；
[0008]S2退火：配置RNase H反应缓冲液，所述DNA引物与所述mRNA在所述反应缓冲液退火结合；
[0009]S3酶切反应：逐步降温反应，至22
±
2℃，加入MgCl2、10U Rnase H酶，在37℃恒温条件下酶切反应20min；
[0010]S4纯化：纯化分离poly(A)尾，得到poly(A)尾。
[0011]本专利技术的第二方面，是提供了一种mRNA的poly(A)尾长度分析方法，包括以下步骤：
[0012]S1设计引物：针对具有待分析的poly(A)尾的mRNA，获得检测DNA引物；
[0013]S2退火：配置RNase H反应缓冲液，所述DNA引物与所述mRNA在所述反应缓冲液退火结合；
[0014]S3酶切反应：逐步降温反应，至22
±
2℃，加入MgCl2、10U Rnase H酶，在37℃恒温条件下酶切反应20
±
3min；
[0015]S4纯化：纯化分离poly(A)尾，得到poly(A)尾；
[0016]S5进行长度检测。
[0017]本专利技术的第三方面，在于提供上述mRNA的poly(A)切割方法在poly(A)尾长度分析中的应用。
[0018]在其中一些实施例中，所述DNA引物为待分析的poly A尾附近mRNA碱基组成能与mRNA互补配对的序列。进一步优选为DNA引物的碱基长度为12nt至20nt。更进一步优选为18nt
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20nt。
[0019]在其中一些实施例中，退火中，所述DNA引物用量为：每pmol的DNA引物用于0.1～0.33pmol的mRNA。例如，30pmol mRNA时，DNA引物的量为90pmol～300pmol。
[0020]在其中一些优选的实施例中，当poly(A )尾是连续时，每pmol的DNA引物用于0.15～0.25pmol的mRNA，更优选为用于0.15～0.20的mRNA；
[0021]当poly(A)尾为分段式时，每pmol的DNA引物用于0.2～0.33pmol的mRNA，优选为用于0.2～0.30的mRNA。
[0022]在其中一些实施例中，所述RNase H反应缓冲液中包括RNase抑制剂，，所述RNase抑制剂在反应体系中的浓度为0.6
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1.3％，更优选为1％(v/v)。合适量的酶抑制剂(RNase Inhibitor)，使反应过程中mRNA更稳定，减小降解的风险。
[0023]在其中一些实施例中，酶切反应中，所述MgCl2的终浓度为2.8
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3.2mM，进一步为2.9
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3.1mM。
[0024]在其中一些实施例中，酶切反应中，所述Rnase H酶用量为：每U的Rnase H酶用于切割0.4～8的pmol mRNA(相当于切割30pmol mRNA时，Rnase H酶的量为在3.75U～75U)，进一步优选为每U的Rnase H酶用于切割2～8的pmol mRNA，更优选为每U的Rnase H酶用于切割2～4的pmol mRNA。
[0025]在其中一些实施例中，纯化中，使用mRNACapture Beads(mRNA分离磁珠)纯化分离poly(A)尾。
[0026]在其中一些实施例中，分析方法是2％琼脂糖凝胶法、LC
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MS(液相色谱
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质谱联用仪(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer)。
[0027]本专利技术具有以下优点：
[0028](1)本专利技术将基于RNase H酶和类似于mRNA加帽率分析方法应用于mRNA的连续或者分段式poly(A)尾长度分析中，并优化方法步骤，合理设计引物，使用的buffer添加了酶
抑制剂等，相比于应用于mRNA加帽效率检测预处理中降低了酶用量和反应时间，加帽效率检本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种mRNA的poly(A)切割方法，其特征是，包括以下步骤：包括以下步骤：S1设计引物：针对具有待分析的poly(A)尾的mRNA，获得检测DNA引物；S2退火：配置RNase H反应缓冲液，所述DNA引物与所述mRNA在所述反应缓冲液退火结合；S3酶切反应：逐步降温反应，至22
±
2℃，加入MgCl2、10U Rnase H酶，在37℃恒温条件下酶切反应20min；S4纯化：纯化分离poly(A)尾，得到poly(A)尾。2.根据权利要求1所述的poly(A)切割方法，其特征是，所述DNA引物为待分析的poly A尾附近mRNA碱基互补配对的序列，优选为DNA引物的碱基长度为12nt至20nt，更优选为18nt
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20nt。3.根据权利要求1所述的poly(A)切割方法，其特征是，退火中，所述DNA引物用量为：每pmol的DNA引物用于0.1～0.33pmol的mRNA。4.根据权利要求3所述的poly(A)切割方法，其特征是，当poly(A)尾是连续时，每pmol的DNA引物用于0.15～0.25pmol的mRNA，更优选为用于0.15～0.20的mRNA。5.根据权利要求3所述的poly(A)切割方法，其特征是，当poly(A)尾为分段式时，每pmol的DNA引物用于0.2～0.33pmol的mRNA，优选为用于0.2～0.30的mRNA。6.根据权利要求1所述的poly(A)切割方法，其特征是，所述RNase H反应缓冲液中包括RNase抑制剂，优选地，所述RNase抑制剂在反应体系中的体积浓度为0.6
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1.3％。7.根据权利要求1所述的poly(A)切割方法，其特征是，酶切反应中，所述MgCl2的终浓度为2.8mM
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3.2mM，优选为2.9mM
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3.1mM。8.根据权利要求1所述的poly(A)切割方法，其特征是，酶切反应中，所述Rnase H酶用量为：每U的Rnase H酶用于切割0.4～8的pmol mRNA，优选为每U的Rnase H酶用于切割2～8的pmol mRNA，更优选为每U的Rnase H酶用于切割2～4的pmol mRNA。9.一种mRNA的poly(A)尾长度分析方法，其特征是，包括以下步骤：S1...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘有东，刘浩，朱蕾，劳楚，饶凤琴，卢丽，宁海升，万季，赵钊，王弈，
申请(专利权)人：深圳市新合生物医疗科技有限公司广州市新合生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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