一种mRNA的polyA尾长度的分析方法技术

本发明专利技术涉及mRNA poly(A)尾的切割方法和分析方法，尤其在分段poly(A)尾的切割方法的应用，所述方法在poly(A)尾附近设计特异性DNA引物，使用RNase H酶切割特性性引物与mRNA的结合物，RNase H反应缓冲液中添加酶抑制剂，所述切割方法能分离获得完整的分段poly(A)尾，而其他酶切法可能会将分段poly(A)尾之间的非A碱基切断。而且，本申请所述方法，还降低了酶用量和反应时间，成本小，操作简单。操作简单。

【技术实现步骤摘要】
一种mRNA的poly A尾长度的分析方法


[0001]本专利技术属于生物技术研究领域，具体是涉及一种基于RNase H酶的mRNA的poly A尾长度的分析方法。

技术介绍

[0002]大多数真核生物的mRNA3
’
末端都有由几十个到几百个不等的A碱基组成的Poly(A)尾巴。它们对于mRNA的稳定性和蛋白翻译非常重要，一些常见生理生化途径可能都会受到Poly(A)长度的调控作用。真核mRNA添加poly(A)尾是一个默认的过程，几乎所有的真核生物mRNA都通过转录后修饰，共获得约250
‑
300个A碱基的Poly(A)尾巴。但随后Poly(A)的长度在细胞核和细胞质中受到了高度调节，不同长度的Poly(A)尾有助于调节成熟mRNA的稳定性、运输和翻译。一旦mRNA到达细胞质，Poly(A)尾巴与5
′
帽协同作用，与翻译起始因子4F(eIF4F)复合物形成稳定的闭环结构，促进翻译起始。Poly(A)尾的长度决定了mRNA翻译的程度，Poly(A)尾的缩短和延长可以很好地反映Poly(A)尾本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种mRNA的poly(A)切割方法，其特征是，包括以下步骤：包括以下步骤：S1设计引物：针对具有待分析的poly(A)尾的mRNA，获得检测DNA引物；S2退火：配置RNase H反应缓冲液，所述DNA引物与所述mRNA在所述反应缓冲液退火结合；S3酶切反应：逐步降温反应，至22
±
2℃，加入MgCl2、10U Rnase H酶，在37℃恒温条件下酶切反应20min；S4纯化：纯化分离poly(A)尾，得到poly(A)尾。2.根据权利要求1所述的poly(A)切割方法，其特征是，所述DNA引物为待分析的poly A尾附近mRNA碱基互补配对的序列，优选为DNA引物的碱基长度为12nt至20nt，更优选为18nt
‑
20nt。3.根据权利要求1所述的poly(A)切割方法，其特征是，退火中，所述DNA引物用量为：每pmol的DNA引物用于0.1～0.33pmol的mRNA。4.根据权利要求3所述的poly(A)切割方法，其特征是，当poly(A)尾是连续时，每pmol的DNA引物用于0.15～0.25pmol的mRNA，更优选为用于0.15～0.20的mRNA。5.根据权利要求3所述的poly(A)切割方法，其特征是，当poly(A)尾为分段式时，每pmol的DNA引物用于0.2～0.33pmol的mRNA，优选为用于0.2～0.30的mRNA。6.根据权利要求1所述的poly(A)切割方法，其特征是，所述RNase H反应缓冲液中包括RNase抑制剂，优选地，所述RNase抑制剂在反应体系中的体积浓度为0.6
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1.3％。7.根据权利要求1所述的poly(A)切割方法，其特征是，酶切反应中，所述MgCl2的终浓度为2.8mM
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3.2mM，优选为2.9mM
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3.1mM。8.根据权利要求1所述的poly(A)切割方法，其特征是，酶切反应中，所述Rnase H酶用量为：每U的Rnase H酶用于切割0.4～8的pmol mRNA，优选为每U的Rnase H酶用于切割2～8的pmol mRNA，更优选为每U的Rnase H酶用于切割2～4的pmol mRNA。9.一种mRNA的poly(A)尾长度分析方法，其特征是，包括以下步骤：S1...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘有东，刘浩，朱蕾，劳楚，饶凤琴，卢丽，宁海升，万季，赵钊，王弈，
申请(专利权)人：深圳市新合生物医疗科技有限公司广州市新合生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：