一种核酸直接扩增试剂盒及其使用方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种核酸直接扩增试剂盒及其使用方法和应用。具体地说，本发明专利技术提供了一种核酸直接扩增试剂盒，包括：Tris

【技术实现步骤摘要】
一种核酸直接扩增试剂盒及其使用方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学检测，尤其涉及一种核酸直接扩增试剂盒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]直扩技术，即直接扩增技术，又称Direct PCR技术或免提取扩增技术，该技术能够利用未经DNA提取与纯化的生物样本直接加入PCR反应体系并获得扩增产物，减少检验步骤，降低检验成本。但是，生物样本通常包含各种干扰扩增的物质，例如细胞中所包含蛋白等杂质。这些杂质的存在会导致直接扩增得到的图谱与实际图谱(通常以提取得到的DNA作为模板扩增得到的图谱)发生偏离(例如Ct值延迟或信号值减弱)。因此，直接扩增试剂在灵敏性和抗干扰性上还需要改善。
[0003]叶酸是一种水溶性B族维生素，人体自身不能合成，必须从外界摄入。孕妇对叶酸的需求量比正常人高4倍，适当补充叶酸能够有效地降低胎儿畸形发生的概率。科学研究发现，叶酸利用能力受遗传结构(基因)影响，如果与叶酸代谢相关的酶活性偏低(即相关基因功能异常)，这一人群如按常量(400微克/天)补充叶酸，机体叶酸水平也会不足。遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。
[0004]通过检测MTHFR(5，1 0
‑
methylenetetrahydrofolate reductase，亚甲基四氢叶酸还原酶)基因和MTRR(Methionine synthase reductase，甲硫氨酸合酶还原酶)基因及其相关位点可以直接知道被检测者叶酸代谢能力是否有遗传缺陷，不同的基因型对应的叶酸补充量不同，叶酸个体化的补充对预防疾病的发生具有重要意义。
[0005]中国专利CN107254520A和CN108004309A，使用DNA直接测序法对MTHFR基因和MTRR基因进行PCR扩增后检测，但该方法需要对扩增后的样品进行纯化、再次扩增分析得到的序列，检测步骤繁琐、复杂，时间和仪器成本高，在临床上具有一定的限制。
[0006]中国专利CN 104774944A、CN 115058507A和CN 105986010A的中国专利公开了使用质谱法检测叶酸代谢相关基因型的方法和试剂盒，这种方法通过引物长度及碱基的相对分子质量进行区分，通量高，灵敏度高但需要结合质谱仪进行分型，使用的仪器设备昂贵，并且对操作人员技术要求高，实用性及普及性受限。同时CN 105986010A方案提出使用全血样本提取核酸检测叶酸代谢能力的试剂盒存在操作时间长、试剂成本高等问题。
[0007]中国专利CN109593846A公开了使用荧光定量PCR进行叶酸代谢相关基因型的方法和试剂盒，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型，检测效率高，同时提供的试剂盒利用碱裂解法的原理快速提取口腔拭子和全血中的DNA，简化了核酸提取的步骤，但是依然需要多次离心加热等步骤，前处理操作依旧繁琐。
[0008]中国专利CN 106868180A本专利技术公开了一种利用全血直接扩增核酸检测叶酸代谢相关基因多态性的方法，无需抽提人基因组DNA，而从全血直接PCR，PCR产物可以不经电泳纯化直接外送商业化公司测序，减少工作量。该专利技术提供了一种良好的前处理方法，但是仍
旧需要测序工作，时间周期和成本较高。
[0009]此外，我们发现一般用于提取基因组DNA的体液通常来自静脉血液中的白细胞，但使用血液作为检测来源具有很多缺点。首先，血液的采集需要经过训练的专业人员操作，其次，血液采集是侵入性方式，经常给供试者带来一定程度的不适和疼痛，此外，血液采集过程还需要避免一些血源性病原体造成的感染。
[0010]本专利技术选择检测样本为唾液或拭子，因为从唾液或拭子中提取DNA相对于传统血液DNA采集方式来说，采集过程简单方便，无需经专业训练的人员即可操作，可避免对受检者造成不必要的痛苦。并且，更为关键的是，唾液和拭子样本往往可以由受试者自己采集，然后通过相应的保存技术运输至实验室进行核酸检验。对于唾液和拭子样本的核酸检测，通常需要在实施PCR之前从所述样品提取和纯化所述核酸。这是因为口腔细胞中的蛋白、杂质能够干扰PCR扩增。从生物样品提取核酸耗费时间，并涉及污染的高风险。考虑到分离和检测生物样品中的核酸分子涉及的高度的复杂性，日益期望不用任何上游核酸提取或大量的预处理步骤，直接检测生物样品中的核酸。
[0011]综上所述，虽然现有技术中通过全血或拭子样本进行核酸分析例如叶酸代谢相关基因型分析的方法，或前处理过程复杂繁琐，或下游检测方案需要通过质谱、测序等周期长、成本高的方式。本专利技术提供一种无需对唾液和拭子进行前处理的免提取过程，结合直扩扩增荧光定量PCR进行核酸检测(例如叶酸代谢相关基因型分析)的直接扩增试剂盒及其使用方法和应用。

技术实现思路

[0012]为了解决现有技术中的一个或多个技术问题，本专利技术在第一方面提供了一种核酸直接扩增试剂盒，所述试剂包括：Tris
‑
SO4，乙酸铵，dNTPs，甘油，MgCl2，耐受型热启动DNA聚合酶和多胺。
[0013]本专利技术在第二方面提供了由本专利技术第一方面所述的试剂盒配制的核酸直接扩增试剂，所述核酸直接扩增试剂包含：10
‑
200mM Tris
‑
S04，10
‑
60mM乙酸铵，100
‑
500μM的dNTPs，1
‑
6％的甘油，1
‑
10mM的MgCl2，0.01
‑
0.2U/μl的耐受型热启动DNA聚合酶和0.1
‑
20mM的多胺。
[0014]本专利技术在第三方面提供了一种对生物样本中的DNA进行分析的方法，所述方法采用本专利技术第一方面所述的试剂盒或本专利技术第二方面所述的核酸直接扩增试剂通过直接扩增对生物样本中的DNA进行定量或定性分析。
[0015]本专利技术在第四方面提供了本专利技术第一方面所述的试剂盒或本专利技术第二方面所述的核酸直接扩增试剂在核酸直接扩增检测中的应用，尤其是在基因多态性分析例如叶酸代谢相关基因多态性检测中的应用。
[0016]相对于现有技术，本专利技术具有如下技术优点：
[0017]采用本专利技术所述的试剂盒配制的核酸直接扩增试剂，可以对来自于生物样本的常温长期存放的DNA粗样本进行定性或定量扩增分析而无需对生物样本进行核酸提取或纯化(例如在用于定量PCR检测分析时Ct值没有出现延迟，信号值没有减弱)，准确率高，而且检测速度快，检测成本低，操作简便。
附图说明
[0018]图1：受试者1号拭子粗样本通过制备例1直接扩增试剂检测的扩增曲线图。
[0019]图2：受试者1号拭子粗样本通过对比制备例a1直接扩增试剂检测的扩增曲线图。
[0020]图3：受试者1号拭子粗样本通过对比制备例a2直接扩增试剂检测的扩增曲线图。
[0021]图4：受试者1号拭子粗样本通过对比制备例a3直接扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸直接扩增试剂盒，所述试剂包括：Tris
‑
SO4，乙酸铵，dNTPs，甘油，MgCl2，耐受型热启动DNA聚合酶和多胺。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述多胺为三胺、四胺或五胺类物质；优选的是，所述多胺为二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺；更优选的是，所述多胺为四亚乙基五胺。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述耐受型热启动DNA聚合酶为苏州白垩纪生物科技有限公司生产的JumboTM Taq Hot
‑
Start DNA Polymerase。4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括扩增目的基因引物和检测探针；优选的是，所述引物为如SEQ ID NO.1和2所示的一对引物；和或所述探针为末端带有荧光信号的核酸部分如SEQ ID NO.3和4所示的两个探针。5.由权利要求1至4中任一项所述的试剂盒配制的核酸直接扩增试剂，其特征在于，所述核酸直接扩增试剂包含：10
‑
200mM Tris
‑
S04，10
‑
60mM乙酸铵，100
‑
500μM的dNTPs，1
‑
6％的甘油，1
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10mM的MgCl2，0.01
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0.2U/μl的耐受型热启动DNA聚合酶和0.1
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【专利技术属性】
技术研发人员：邹永龙，曲峰，何宗顺，张佳斌，
申请(专利权)人：苏州白垩纪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：