低氧应激的时空转录组图谱的构建方法及构建得到的图谱技术

本发明专利技术涉及细胞技术领域，尤其涉及一种低氧应激的跨时间、跨组织转录组图谱的构建方法及构建得到的图谱。构建方法包括：构建不同低氧条件下的缺氧应激实验动物模型；构建不同低氧条件下多组织器官的单细胞/细胞核测序文库；对单细胞测序文库和细胞核测序文库进行测序和分析，构建得到低氧应激的跨时间、跨组织转录组图谱。本发明专利技术提出的构建方法通过测序和分析构建得到的跨时间、跨组织转录组图谱具有很强的一致性。本发明专利技术构建得到的图谱可用于从细胞类型组成、细胞和组织特异性差异表达基因、核心调控转录因子以及与缺氧相关疾病风险基因联合分析等方面评估低氧对不同组织和细胞类型的作用，为缺氧相关疾病的研究提供了新的视角。的视角。

【技术实现步骤摘要】
低氧应激的时空转录组图谱的构建方法及构建得到的图谱
[0001]本申请要求2022年8月25日提交的申请号为2022110281241的中国专利申请的全部优先权。该申请的全部内容全部以引用方式并入本文。


[0002]本专利技术涉及细胞
，尤其涉及一种低氧应激的跨时间、跨组织转录组图谱的构建方法及构建得到的图谱。

技术介绍

[0003]氧气是生物反应的主要底物，氧气水平的波动会对生物体造成强烈的压力。低氧会导致组织和器官发生一系列变化，包括低氧反应和低氧损伤。低氧损伤涉及多种疾病，包括急性高原病、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症以及慢性阻塞性肺疾病等，缺氧也已成为推动covid
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19疫情发展的关键因素。面对低氧应激，各个组织器官都会经历一系列的机制。尽管2019年的诺贝尔生理学或医学奖是基于缺氧诱导因子(HIF)依赖的缺氧反应的发现，但在这一领域仍有许多未解的问题。
[0004]事实上，每个器官的缺氧反应的程度和过程是不同的，同一器官中不同类型的细胞在这一过程中也起着不同的生理或病理作用。缺氧应激是一个极其复杂的调节过程，涉及多器官、多系统和多细胞的相互作用。然而，其具体的异质性和交互关系尚不清楚。
[0005]单细胞RNA测序技术的发展使得充分了解细胞异质性成为可能。虽然已经建立了生理、衰老或疾病状态下的各种跨器官单细胞转录组图谱，但目前还缺乏对低氧应激的系统和全面的单细胞研究。
[0006]目前已建立的单细胞转录图谱大部分是在生理条件下产生的，病理条件下的生物学变化机制仍有待探索。鉴于低氧应激不仅是生物体适应环境变化的重要机制，也是多种疾病的共同特征，因此迫切需要建立一个单细胞转录图谱来阐明低氧应激反应的生理和病理效应。
[0007]综上所述，如何提供一种构建低氧应激时空转录组图谱的方法，获取重要器官缺氧反应更多的信息，为进一步探索缺氧反应及缺氧相关疾病的机制提供理论基础，是低氧研究领域亟待解决的问题之一。

技术实现思路

[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种低氧应激的跨时间、跨组织转录组图谱的构建方法及构建得到的图谱。
[0009]本专利技术提供了一种低氧应激的跨时间、跨组织转录组图谱的构建方法，至少包括以下步骤：
[0010]S1、构建不同低氧条件下的缺氧应激实验动物模型；
[0011]S2、构建不同低氧条件下多组织器官的单细胞/细胞核转录组库；
[0012]S3、对单细胞/细胞核转录组库进行测序和分析，构建得到低氧应激的跨时间、跨
组织转录组图谱。
[0013]可选的，在S1中，不同低氧应激条件包括低氧7天组、低氧14天组；同时设立正常组作为对照；
[0014]低氧7天组的处理条件为：氧气体积百分比浓度从21％到7％，每天降低1％，时间为14天，当体积百分比浓度降低至7％后，7％氧气体积百分比浓度再处理7天；
[0015]低氧14天组的处理条件为：氧气体积百分比浓度从21％到7％，每天降低1％，时间为14天，当体积百分比浓度降低至7％后，7％氧气体积百分比浓度再处理14天；
[0016]正常组：氧气体积百分比浓度为21％；优选的，实验动物为小鼠。
[0017]可选的，S2包括：
[0018]S21、收集多组织器官：多组织器官包括脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、骨髓和肾脏中的至少一种；将脑、心脏、肝脏、肾脏分别制备成细胞核悬液；骨髓、肺和脾脏分别制备成单细胞悬液；
[0019]S22、将细胞核悬液和单细胞悬液制备成单细胞/细胞核转录组库，建索引库并定量。
[0020]可选的，S21中，细胞核悬液的浓度为每μL中含有1500个细胞核；单细胞悬液的浓度为每μL中含有1500个细胞；
[0021]S22中，用于构建单细胞测序文库和细胞核测序文库的单细胞总数不少于10万个。
[0022]可选的，在S3中，测序采用DIPSEQ T7测序仪，按照以下测序策略进行测序：read 1的读取长度为41bp，read 2的读取长度为100bp；获得scRNA
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seq和snRNA
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seq数据集；分析包括：对scRNA
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seq和snRNA
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seq数据集的处理，scRNA
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seq和snRNA
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seq数据集中的细胞聚类和定义，差异表达基因分析、GO和KEGG富集。
[0023]可选的，对scRNA
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seq和snRNA
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seq数据集的处理，包括：
[0024]S301、原始数据处理：解复用来自DIPSEQ
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T7的原始测序的碱基序列；
[0025]S302、用STAR对比软件对碱基序列与参考基因组进行比对；对于用单细胞测序文库测序的组织，基因的转录本通过外显子计数；对于用细胞核测序文库测序的组织，基因的转录本包括外显子和内含子一起读取；参考基因组选自GRCm38(mm10)；
[0026]S303、使用蛋白质原位阵列生成细胞或细胞核与基因唯一的分子标识符计数矩阵；
[0027]S304、去除干扰RNA，包括：利用SoupX减少环境RNA干扰；利用函数autoEstCont自动参数化污染指数，污染指数值在原来的基础上增加0.1。
[0028]可选的，scRNA
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seq和snRNA
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seq数据集中的细胞聚类和定义，包括：
[0029]S305、使用DoubletFinder删除每个库中具有默认参数的二聚体，并排除与伪二聚体最相似的5％的细胞；
[0030]S306、筛选出少于500个基因、1000个UMI或10000个读数的细胞或细胞核，排除线粒体基因计数超过10％的细胞或细胞核；
[0031]S307、使用Seurat程序在R环境中执行无监督聚类：合并来自同一组织的文库，对每个组织数据执行NormalizeData和FindVariableGene功能，用vst方法找出前3000个最可变的基因；缩放每个组织的合并数据并计算PCA，然后使用前20个主成分执行UMAP；使用相同的方法建立包含所有组织的图谱；优选的，当合并的组织数据具有批次效应时，使用
FindIntegrationAnchors和IntegratedData函数执行CCA算法以消除批次效应；
[0032]S308、使用函数FindClusters以最佳分辨率计算细胞簇；
[0033]S309、使用已发表研究中的经典标记和细胞标记来确定细胞；移除表达多种细胞类型标记的簇。
[0034]本专利技术还涉及上述构建方法构建得到的低氧应激跨时间、跨组织转录组图谱。
[0035]本专利技术提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
[0036]本专利技术提出一种低氧应激的跨时间、跨组织转录组图谱的构建方法，提出了利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低氧应激的跨时间、跨组织转录组图谱的构建方法，其特征在于，至少包括以下步骤：S1、构建不同低氧条件下的缺氧应激实验动物模型；S2、构建不同低氧条件下多组织器官的单细胞/细胞核转录组库；S3、对所述单细胞/细胞核转录组库进行测序和分析，构建得到所述低氧应激的跨时间、跨组织转录组图谱。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在S1中，所述不同低氧应激条件包括低氧7天组、低氧14天组；同时设立正常组作为对照；低氧7天组的处理条件为：氧气体积百分比浓度从21％到7％，每天降低1％，时间为14天，当体积百分比浓度降低至7％后，7％氧气体积百分比浓度再处理7天；低氧14天组的处理条件为：氧气体积百分比浓度从21％到7％，每天降低1％，时间为14天，当体积百分比浓度降低至7％后，7％氧气体积百分比浓度再处理14天；正常组：氧气体积百分比浓度为21％；优选的，所述实验动物为小鼠。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S2包括：S21、收集所述多组织器官：所述多组织器官包括脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、骨髓和肾脏中的至少一种；将脑、心脏、肝脏、肾脏分别制备成细胞核悬液；骨髓、肺和脾脏分别制备成单细胞悬液；S22、将所述细胞核悬液和单细胞悬液制备成单细胞/细胞核转录组库，建索引库并定量。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，S21中，细胞核悬液的浓度为每μL中含有1500个细胞核；单细胞悬液的浓度为每μL中含有1500个细胞；S22中，用于构建单细胞测序文库和细胞核测序文库的单细胞总数不少于10万个。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在S3中，所述测序采用DIPSEQ T7测序仪，按照以下测序策略进行测序：read 1的读取长度为41bp，read 2的读取长度为100bp；获得scRNA
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seq和snRNA
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seq数据集；所述分析包括：对scRNA
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seq和snRNA
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seq数据集的处理，scRNA
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seq和snRNA
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seq数据集中的细胞聚类和定义，差异表达基因分析、GO和KEGG富集。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述对scRNA
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seq和snRNA
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seq数据集的处理，包括：S301、原始数据处理：解复用来自DIPSEQ
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T7的原始测序的碱基序列；S302、用STAR对比软件对所述碱基序列与参考基因组进行比对；对于用单细胞测序文库测序的组织，基因的转录本通过外显子计数；对于用细胞核测序文库测序的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘心，吉训明，王岳，刘佳，张蘇予，杨晨露，谷亚坤，关玉莹，郭梦圆，李雨凝，
申请(专利权)人：北京脑重大疾病研究院，
类型：发明
国别省市：