一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法技术

本发明专利技术公开了一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，属于分析化学领域，具体涉及通过叠氮衍生物探针1,3‑吲二酮(AI)对5‑醛基胞嘧啶(5‑fC)进行叠氮(N

A visual method for spatial location and adjacent distribution of epigenetic modification of single cell DNA

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法
本专利技术属于分析化学领域，涉及一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法。
技术介绍
哺乳动物基因组中存在着不同的DNA表观遗传标记。这些表观遗传标记对基因表达和染色质结构都有着深远的影响，并与很多疾病(如癌症等)的病理有关。在基因的表观遗传标记中，研究较多的是5-甲基胞嘧啶(5-mC)及其氧化衍生物5-hmC和5-fC，经过研究发现，它们不仅是5-mC去甲基化通路的中间产物，而且也具有很好的稳定性。这两种DNA表观遗传标记都是由双加氧酶的10-11易位家族产生的。表观遗传标记在单细胞中的空间定位也是理解其功能的基础，不同的表观遗传标记如果在空间上呈临近分布状态，则它们可能会有相互干扰作用或者它们所表达的蛋白质之间会有相互作用。针对这些修饰碱基，当前已经有几种用于全基因组分析的深度测序策略，可以揭示它们在正常生物过程和疾病发生过程中的重要功能。但是这些深度测序的方法都是针对细胞群体平均进行分析，并且不能实现修饰碱基在亚细胞分布的可视化。在针对DNA表观遗传标记空间邻近分布的研究方法中，传统的基于荧光原位杂交的细胞成像仅限于检测感兴趣的序列，不足以评估碱基修饰；免疫分析仅限于在裸DNA中使用抗体与DNA修饰(如5hmC)结合，且当抗体蛋白的尺寸较大时，DNA结合蛋白或浓缩染色质中所覆盖的碱基位点就会对免疫蛋白的识别产生影响，导致识别率下降。不仅如此，这种抗体与DNA非共价的、基于亲和力的方法识别特异性和结合效率较低，并且无法对有不同表观遗传标记碱基的空间邻近性进行研究；相比之下，基于化学酶或化学的方法在对5-hmC或5-fC进行标记时，可以更准确和更全面的实现DNA表观遗传位点的标记。然而，因为在细胞内环境中含有大量修饰碱基的类似物，会对识别造成干扰，所以该方法还没有在真实的细胞内环境中进行过应用。因此当前的研究方法不能获取DNA表观遗传标记空间邻近分布的信息。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，该方法能够实现单细胞内5-fC/5-hmC依次原位特异性标记，且标记过程具有高度特异性，能够有效避免干扰，反应效率高、反应条件简单、反应速度快。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开了一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，包括以下步骤：1)利用特异性标记方法，标记单细胞内DNA表观遗传修饰位点；2)通过点击化学将标记为点共价连接上对应的引物，成对的临近修饰位点的引物能够对有缺口的环模板实现原位临近连接，得到完整环模板Pad1；3)对于剩余不成对的修饰位点，引物通过链置换反应被释放，接着利用特异性环模板Pad2和Pad3分别对修饰位点进行杂交，实现修饰位点的空间定位与邻近分布特征编码；4)编码完成后，通过核酸扩增、荧光探针杂交，实现单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的单分子可视化区分。优选地，修饰位点为5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。进一步优选地，步骤1)中，是利用叠氮衍生物探针1,3-吲二酮对5-醛基胞嘧啶进行叠氮官能团的化学标记，利用T4噬菌体β葡萄糖基转移酶对5-羟甲基胞嘧啶进行叠氮官能团的酶介导标记。具体操作如下：将含有10mMAI和10％二甲基亚砜的20μL1×MES缓冲液加入到反应室中，并在37℃下孵育24h。随后利用点击化学反应，将含有100nM二苯并环辛炔DBCO修饰引物探针P1-fC的1×PBS缓冲液加入到反应室，在37℃下反应1h。再向反应室中加入20μL含1×NEBuffer4，50μM的UDP-N3-Glu和5U的T4β-GT的反应液，37℃孵育2h。最后再向反应室加入100nMP2-hmC探针，在37℃下反应1h。每次向反应室加入反应液前先将上一步的反应液移除，并使用PBS清洗反应室三遍。优选地，步骤2)中，对单细胞内5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶修饰位点依次顺序进行特异性标记、点击化学共价连接上对应的RCA引物P1-5-醛基胞嘧啶及P2-5-羟甲基胞嘧啶后，成对的临近位点的引物共同对有缺口的环模板实现原位临近连接，得到完整环模板Pad1。具体操作如下：对单细胞内5-fC和5-hmC修饰位点依次顺序进行特异性标记、点击化学共价连接上对应的RCA引物(P1-fC及P2-hmC)后，成对的临近位点的引物共同对有缺口的环模板实现原位临近连接，得到完整环模板(Pad1)。即，在1×T4DNA连接酶缓冲液中加入含10UT4DNA连接酶的L-proxi和Pad-proxi探针，分别与两种引物DNA探针P1-fC和P2-hmC进行原位杂交和连接。实现5-fC和5-hmC的邻近分布特征编码。优选地，步骤3)中，对于剩余不成对的修饰位点，引物通过链置换反应被释放，包括如下操作：在邻近位点的引物发生原位连接后，剩余不成对的5-fC和5-hmC修饰位点，引物通过链置换反应被释放，即，在邻近位点进行原位杂交和连接后，使用200nM的Disp-fC和Disp-hmC在37℃条件下进行链置换反应，将5-fC或5-hmC位点上的过量探针置换出来。优选地，步骤3)中，对发生链置换反应后的表观遗传修饰位点进行特异性环模板杂交，包括如下操作：在将5-fC或5-hmC位点上的过量探针置换出来后，利用对应的特异性环模板(Pad2及Pad3)对该位点进行杂交。即，将制备的200nM的5-fC/5-hmC特异性环状DNA条码探针加入反应室中，在37℃下孵育2h。实现5-fC和5-hmC的空间定位编码。优选地，步骤4)中，进行RCA扩增、杂交荧光探针以及荧光成像，包括如下操作：将含有10Uφ29DNA聚合酶和2mMdNTP的1×φ29DNA聚合酶缓冲液加入到反应室中，在37℃下反应2h。最后荧光探针与RCA扩增产物在含20％甲酰胺的2×SSC缓冲液中杂交。荧光探针杂交后，用DAPI染色细胞核，激光扫描共聚焦显微镜(TCSSP8STED3X，Leica)进行成像。每次向反应室加入反应液前先将上一步的反应液移除，并使用PBS清洗反应室三遍。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开的单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，通过叠氮衍生物探针1,3-吲二酮(AI)对5-醛基胞嘧啶(5-fC)进行叠氮(N3)官能团的化学标记、利用T4噬菌体β葡萄糖基转移酶(β-GT)对5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)进行叠氮(N3)官能团的酶介导标记；成对的临近位点的引物共同对有缺口的环模板实现原位临近连接，剩余不成对的5-fC和5-hmC修饰位点，引物通过链置换反应被释放，接着杂交对应的特异性环模板；并结合核酸扩增、荧光探针杂交，实现单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的单分子可视化区分。该方法的优势体现在：1、对单细胞内5-fC/5-hmC依次进行原位特异性标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)利用特异性标记方法，标记单细胞内DNA表观遗传修饰位点；/n2)通过点击化学将标记为点共价连接上对应的引物，成对的临近修饰位点的引物能够对有缺口的环模板实现原位临近连接，得到完整环模板Pad1；/n3)对于剩余不成对的修饰位点，引物通过链置换反应被释放，接着利用特异性环模板Pad2和Pad3分别对修饰位点进行杂交，实现修饰位点的空间定位与邻近分布特征编码；/n4)编码完成后，通过核酸扩增、荧光探针杂交，实现单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的单分子可视化区分。/n

【技术特征摘要】
1.一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用特异性标记方法，标记单细胞内DNA表观遗传修饰位点；
2)通过点击化学将标记为点共价连接上对应的引物，成对的临近修饰位点的引物能够对有缺口的环模板实现原位临近连接，得到完整环模板Pad1；
3)对于剩余不成对的修饰位点，引物通过链置换反应被释放，接着利用特异性环模板Pad2和Pad3分别对修饰位点进行杂交，实现修饰位点的空间定位与邻近分布特征编码；
4)编码完成后，通过核酸扩增、荧光探针杂交，实现单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的单分子可视化区分。


2.根据权利要求1所述的一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永席，陈锋，薛静，张进，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61