一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法技术

本发明专利技术公开了一种BCR‑ABL1激酶结构域突变筛查方法，包括如下步骤：从样本中分离单个核细胞并提取RNA；将提取的RNA进行逆转录为cDNA，并进行PCR反应、纯化，获得包括BCR‑ABL1激酶结构域的扩增产物；对扩增产物进行测序文库构建；将测序文库在PGM测序平台上进行测序，根据测序结果确定突变位点及其变异等位基因频率，再根据突变位点的变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式；本发明专利技术筛查方法能够准确获得样本序列中突变位点及其变异等位基因频率，确定低水平突变(＜20％)以及复合突变和多克隆突变；此外，该筛查方法结合巢式PCR的特点，采用特异性引物搭配使用，使得本发明专利技术筛查方法具有较高灵敏度和特异性具有较高的筛查灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法。
技术介绍
在BCR-ABL1融合基因阳性的白血病患者中出现BCR-ABL1激酶结构域(kinasedomain,KD)突变是对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors,TKIs)治疗耐药的常见机制。在几乎所有研究中，当疾病复发时，在50％-80％的患者可检测到BCR-ABL1KD的突变。这些突变在生化和细胞分析中提示具有较高的IC50值。BCR-ABL1阳性白血病患者中最常见的imatinib耐药突变位点是T315I，除了ponatinib或单克隆抗体，其余第二代TKI(2G-TKIs)对T315I均无效。突变阳性的患者表现出极高的遗传不稳定性，这可能促进在相同(“复合”突变,compoundmutations)或不同(“多克隆”突变,polyclonalmutations)的BCR-ABL1融合基因阳性的细胞亚群中获得更多的突变，从而产生复杂的突变模式。越来越多的证据表明，合理使用微小本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(a)从样本中分离单个核细胞并提取RNA；/n(b)将提取的RNA进行逆转录为cDNA，并进行PCR反应、纯化，获得包括BCR-ABL1激酶结构域的扩增产物；/n(c)对扩增产物进行测序文库构建；/n(d)将测序文库在PGM测序平台上进行测序，根据测序结果确定突变位点及其变异等位基因频率，再根据突变位点及其变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式。/n

【技术特征摘要】
1.一种BCR-ABL1激酶结构域突变筛查方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)从样本中分离单个核细胞并提取RNA；
(b)将提取的RNA进行逆转录为cDNA，并进行PCR反应、纯化，获得包括BCR-ABL1激酶结构域的扩增产物；
(c)对扩增产物进行测序文库构建；
(d)将测序文库在PGM测序平台上进行测序，根据测序结果确定突变位点及其变异等位基因频率，再根据突变位点及其变异等位基因频率判断是否出现对TKI耐药的突变位点以及突变模式。


2.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，所述根据测序结果确定是否发生突变包括：
将测序结果与hg19基因组数据进行对比分析，确定突变位点及其变异等位基因频率。


3.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，所述单个核细胞的数量为(5～8)×106个。


4.根据权利要求1所述的筛查方法，其特征在于，所述PCR反应包括巢式第一轮PCR反应和巢式第二轮PCR反应，巢式第二轮PCR反应以巢式第一轮PCR反应产物作为反应原料。


5.根据权利要求4所述的筛查方法，其特征在于，所述巢式第一轮PCR反应采用的引物序列为：
BCR190F：5’-TCCTTCGACAGCAGCAGTCC-3’；
BCR210F：5’-GAGCAGCAGAAGAAGTGTTTCAGA-3’；
ABL1R：5’-CAGGCACGTCAGTGGTGTCTC-3’。


6.根据权利要求4或5所述的筛查方法，其特征在于，所述第一轮PCR反应控制条件为：一次98℃下预变形20s；98℃下变形1s，60℃下退火20s，72℃下延伸30s，进行15个PCR循环。


7.根据权利要求4所述的筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红星，滕文，谭印成，陈佳琦，
申请(专利权)人：北京陆道培生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11