一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法及试剂盒，属于分子检测技术领域。为了克服现有技术在检测同源重组缺陷时未考虑同源重组通路上的其他基因的技术不足，本发明专利技术提供基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法及试剂盒，该方法中通过将待测基因打断后加上A接头，进行相应PCR反应后使用设计的探针进行杂交捕获，将捕获后的DNA文库进行扩增后进行文库测序后使用软件进行评估即可确定同源重组通路基因突变。该方法相对于现有技术具有检测基因全面，数据结果可靠，适宜进行推广。

【技术实现步骤摘要】
一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法及试剂盒
本专利技术涉及一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法及试剂盒，属于分子检测

技术介绍
同源重组(HomologousRecombination)是指发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组可以使受损的染色体通过与另一条未受损染色体的相同DNA进行自身的修复，这种修复保证了基因组的完整性。当细胞出现同源重组基因突变，导致同源重组缺陷(homologousrecombinationdeficiency，HRD)时，细胞不能通过同源重组的方式对DNA进行自身修复。比如我们熟知的乳腺癌肿瘤相关基因BRCA1和BRCA2就是同源重组蛋白。当个体的BRCA1和BRCA2两基因发生突变时，其乳腺癌终生风险为87％，患卵巢癌的风险也超过40％，而且会导致发病年龄提前。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PolyADP-ribosePolymerase，PARP)是一种DNA修复酶，在DNA修复通路中起关键作用。DNA损伤断裂时会激活PARP，它作为DNA损伤的一种分子感受器，具有识别、结合到DNA断裂位置的功能，进而激活、催化受体蛋白的聚ADP核糖基化作用，参与DNA的修复过程。因此，PARP抑制剂是一种靶向聚ADP核糖聚合酶的癌症疗法，它能将导致同源重组修复功能缺陷的肿瘤细胞发生合成致死，但不影响正常细胞，由此产生高选择性抗肿瘤作用。研究发现携带BRCA突变的肿瘤细胞对PARP抑制剂的敏感度高。同源重组修复通路非常复杂，其突变的检测存在一定难度，因此建立准确、可靠、灵敏的检测方法具有十分重要的意义。但目前的同源重组通路基因检测方法中未能实现基因的全部覆盖，当前的检测方法未考虑同源重组基因的内含子区域，更没有考虑同源重组通路上的其他基因。如在检测BRCA1、BRCA2基因突变的方法中，同源重组修复基因的靶向测序主要涉及BRCA1、BRCA2基因的外显子区域，并没有考虑到BRCA1、BRCA2的内含子区域以及通路上的其他基因。BRCA1、BRCA2的外显子长度40nt到4931nt之间，内含子长度在92nt到14544nt之间。BRCA1、BRCA2上长度小于50nt的大片段缺失已经证明可以影响BRCA1、BRCA2的正常功能。对于长度较短且两侧内含子过长的外显子，捕获整个基因优于仅捕获外显子区域，增加了检测的准确性。另外研究表明同源重组通路上的ATM基因具有细胞周期阻滞以及DNA损伤后修复的功能，ATM蛋白已经成为PARP抑制剂的靶点之一。RAD51产生的蛋白与单链和双链DNA结合，催化同源DNA间的识别和链交换，在同源重组修复过程中发挥重要功能。RAD51foci无法形成是同源重组修复通路失效细胞的特征之一。每一个同源重组修复基因失效都有可能导致基因组不稳定的发生。基于此，本专利技术提供一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法及试剂盒。
技术实现思路
现有技术在检测同源重组修复通路基因的突变时存在如下不足：1.现有技术在检测同源重组缺陷时，并没有考虑同源重组通路上的其他基因。2.现有产品没有加入突变特征作为辅助判断同源重组修复通路功能活性的方法。3.现有产品没有加入双等位基因致病突变负荷的计算，因此造成灵敏度较低，特异性较差。本专利技术提供一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法及试剂盒。本专利技术提供一种同源重组修复基因致病点突变及插入缺失突变、同源重组修复基因双等位基因致病突变负荷、同源重组修复基因突变特征、同源重组修复基因拷贝数变异、同源重组修复基因拷贝数负荷、中的一个或者多个的综合值来判断患者是否存在同源重组功能缺失的检测试剂盒。所述同源重组修复基因致病点突变及插入缺失突变、同源重组修复基因双等位基因致病突变负荷、同源重组修复基因突变特征、同源重组修复基因拷贝数变异、同源重组修复基因拷贝数负荷通过利用相关的靶向基因设计的探针(gene-panel)捕获的肿瘤样本以及正常样本测序得到。所述对肿瘤样本同源重组修复基因突变特征的计算主要通过同源重组基因靶向测序数据统计，主要步骤包括：1)对snv进行识别并注释到基因水平；2)根据注释结果进行筛选；3)使用软件(sigma)进行突变特征分析。其中，同源重组修复基因致病点突变及插入缺失突变的识别通过同源重组靶向基因测序统计得到。所述同源重组修复基因双等位基因致病突变负荷的计算主要通过统计同源重组修复基因的拷贝数以及等位基因频率得到。所述同源重组修复基因拷贝数负荷为通过计算每个超出阈值拷贝数变化的基因的数量。一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法，其包括如下步骤：A)将FFPEDNA和BCDNA浓度稀释至6ng/μL，使用CovarisM220打断仪对片段进行处理得到片段化DNA；B)将片段化DNA加入到末端修复加A反应体系进行第一轮PCR反应，得到末端加A的片段化DNA；向反应完毕的PCR反应体系中加入配置好的连接体系进行第二轮PCR反应，反应完毕后使用磁珠纯化得到纯化后的连接产物；C)向纯化后的连接产物加入配置好的扩增体系，按照98℃45sec，1循环；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，N循环，72℃1min，1循环的反应程序进行PCR反应，8℃下终止反应，使用磁珠纯化后得到DNA文库；使用Qubit定量使得FFPEDNA文库≥350ng，BCDNA文库≥200ng，并用2100生物分析仪对文库分析，主峰应位于150～500bp之间；D)杂交捕获：将FFPEDNA文库和BCDNA文库按照质量比1：1进行混合，向混合后的DNA文库加入人类CotDNA和封阻序列，使用真空离心浓缩仪将DNA文库蒸干；E)向蒸干后的DNA文库加入DNA杂交体系，震荡混匀离心后室温孵育，按照95℃30s，65℃4h的杂交反应条件进行杂交，即可得到捕获后的文库；F)捕获后文库扩增：向捕获后的文库中加入文库扩增反应体系，按照98℃45sec，1循环；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，14循环，72℃1min，1循环的反应程序进行PCR反应得到扩增产物；使用磁珠纯化扩增产物；G)文库测序：按照FFPEDNA文库和BCDNA文库以6:1比例进行混合，测试试剂对应位置，使用NextSeqCN500基因测序仪上机测序；使用软件对数据进行处理，去掉接头、引物以及低质量的序列；使用二代测序数据比对软件bwa将预处理所得gene-panel的原始数据比对到人类参考基因组上，得到每条序列的位置信息以及比对质量信息，然后使用软件(如Picard)对比对得到的结果进行质量评估。上述所述的检测方法中，末端修复加A反应步骤中第一轮PCR反应中，反应体系中包括末端修复酶2μL，末端修复缓冲液10μL，无核酸酶水48μL，反应条件为20℃，30min；65℃，30min；4℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法，其特征在于，其包括如下步骤：/nA)将FFPE DNA和BC DNA浓度稀释至6ng/μL，使用Covaris M220打断仪对片段进行处理得到片段化DNA；/nB)将片段化DNA加入到末端修复加A反应体系进行第一轮PCR反应，得到末端加A的片段化DNA；向反应完毕的PCR反应体系中加入配置好的连接体系进行第二轮PCR反应，反应完毕后使用磁珠纯化得到纯化后的连接产物；/nC)向纯化后的连接产物加入配置好的扩增体系，按照98℃45sec，1循环；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，N循环，72℃1min，1循环的反应程序进行PCR反应，8℃下终止反应，使用磁珠纯化后得到DNA文库；使用Qubit定量使得FFPE DNA文库≥350ng，BC DNA文库≥200ng，并用2100生物分析仪对文库分析，主峰应位于150～500bp之间；/nD)杂交捕获：将FFPE DNA文库和BC DNA文库按照质量比1：1进行混合，向混合后的DNA文库加入人类Cot DNA和封阻序列，使用真空离心浓缩仪将DNA文库蒸干；/nE)向蒸干后的DNA文库加入DNA杂交体系，震荡混匀离心后室温孵育，按照95℃30s，65℃4h的杂交反应条件进行杂交，即可得到捕获后的文库；/nF)捕获后文库扩增：向捕获后的文库中加入文库扩增反应体系，按照98℃45sec，1循环；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，14循环，72℃1min，1循环的反应程序进行PCR反应得到扩增产物；使用磁珠纯化扩增产物；/nG)文库测序：按照FFPE DNA文库和BC DNA文库以6:1比例进行混合，测试试剂对应位置，用Illumina公司生产的基因测序仪NextSeq CN500上机测序；使用软件对数据进行处理，去掉接头、引物以及低质量的序列；使用二代测序数据比对软件bwa将预处理所得gene-panel的原始数据比对到人类参考基因组上，得到每条序列的位置信息以及比对质量信息，然后使用软件(如Picard)对比对得到的结果进行质量评估。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
A)将FFPEDNA和BCDNA浓度稀释至6ng/μL，使用CovarisM220打断仪对片段进行处理得到片段化DNA；
B)将片段化DNA加入到末端修复加A反应体系进行第一轮PCR反应，得到末端加A的片段化DNA；向反应完毕的PCR反应体系中加入配置好的连接体系进行第二轮PCR反应，反应完毕后使用磁珠纯化得到纯化后的连接产物；
C)向纯化后的连接产物加入配置好的扩增体系，按照98℃45sec，1循环；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，N循环，72℃1min，1循环的反应程序进行PCR反应，8℃下终止反应，使用磁珠纯化后得到DNA文库；使用Qubit定量使得FFPEDNA文库≥350ng，BCDNA文库≥200ng，并用2100生物分析仪对文库分析，主峰应位于150～500bp之间；
D)杂交捕获：将FFPEDNA文库和BCDNA文库按照质量比1：1进行混合，向混合后的DNA文库加入人类CotDNA和封阻序列，使用真空离心浓缩仪将DNA文库蒸干；
E)向蒸干后的DNA文库加入DNA杂交体系，震荡混匀离心后室温孵育，按照95℃30s，65℃4h的杂交反应条件进行杂交，即可得到捕获后的文库；
F)捕获后文库扩增：向捕获后的文库中加入文库扩增反应体系，按照98℃45sec，1循环；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，14循环，72℃1min，1循环的反应程序进行PCR反应得到扩增产物；使用磁珠纯化扩增产物；
G)文库测序：按照FFPEDNA文库和BCDNA文库以6:1比例进行混合，测试试剂对应位置，用Illumina公司生产的基因测序仪NextSeqCN500上机测序；使用软件对数据进行处理，去掉接头、引物以及低质量的序列；使用二代测序数据比对软件bwa将预处理所得gene-panel的原始数据比对到人类参考基因组上，得到每条序列的位置信息以及比对质量信息，然后使用软件(如Picard)对比对得到的结果进行质量评估。


2.根据权利要求1所述的基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法，其特征在于，末端修复加A反应步骤中第一轮PCR反应中，反应体系中包括末端修复酶2μL，末端修复缓冲液10μL，无核酸酶水48μL，反应条件为20℃，30min；65℃，30min；4℃终止反应；第二轮PCR反应的反应体系包含DNA连接缓冲液30μL，DNA连接酶3μL，连接增强子0.5μL，接头2.5μL，无核酸酶水14μL；反应条件为20℃，15min，4℃终止反应。


3.根据权利要求1所述的基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法，其特征在于，所述步骤C)中纯化后的连接产物为FFPEDNA时，N为8；纯化后的连接产物为BCDNA时，N为6；步骤C)中所述的扩增体系中包括纯化后的连接产物20μL，高保真热启动酶混合液25μL，文库扩增引物5μL。


4.根据权利要求1所述的基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法，其特征在于，所述的DNA杂交体系包括杂交缓冲液2.7μL，杂交缓冲液增强子8.5μL，DNA捕获探针4.5μL，无核酸酶水1.3μL。


5.根据权利要求1所述的基于二代测序技术检测同源重组通路基因突变的方法，其特征在于，所述的文库扩增反应体系中包括高保真热启动酶混合液25μL、文库扩增引物5μL和上一步洗脱的DNA20μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘异倩，闫慧婷，吕红，刘小莉，陈敏俊，陈维之，郑杉，何骥，杜波，
申请(专利权)人：臻悦生物科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32