一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术涉及一种基因多态性检测的方法及其应用。本发明专利技术所述基因多态性检测的方法针对检测靶序列设计上游引物、下游引物、标签引物和标记探针，采用对称扩增+标签引物的方式进行扩增检测。采用本发明专利技术方法可同时检测覆盖区域上的已知、未知等多个不同类型的突变，能够有效降低不同引物体系间的扩增效率差异问题，还能有效解决高GC模板扩增问题。

【技术实现步骤摘要】
一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种基因多态性检测的方法及应用。
技术介绍
目前用于基因突变检测的方法主要有以下几种：高分辨率熔解曲线、PCR荧光探针、基因芯片、测序等。四种主要的基因检测方法，都是基于PCR扩增技术衍生而来，测序法是该领域检测的金标准，既能检测已知位点，又能检测未知位点，测序检测过程包含PCR扩增、测序，操作繁琐，检测时间一般长达4～5个小时，而且操作过程中需要打开PCR反应管，容易带来PCR产物的污染；PCR荧光探针在进行基因突变检测，操作相对简单，但仅能识别和检测已知的突变位点，对于该未知区域未知的突变或未设计包含的突变情况无法检出；基因芯片检测过程包含PCR扩增、探针杂交，操作繁琐，检测时间一般长达4～5个小时，而且操作过程中需要打开PCR反应管，容易带来PCR产物的污染；高分辨率熔解曲线分型法的特征是利用多态性位点的碱基不同而带来的Tm值差别，通过识别不同的Tm值而进行检测，往往野生型和突变型位点的Tm值差别不到1℃，所以需要精准识别温度的设备，这类设备比较少，而且属于进口，价格昂贵。除此之外，市场上还有一种传统PCR-熔解曲线技术，其技术原理多是采用上游引物及下游引物通过不对称扩增的方式获得单链产物，随后探针与单链产物形成熔解曲线进行靶序列的信息分析，该技术在应用于多重PCR扩增时，同一反应孔中不同靶序列的扩增效率不一致，存在相互竞争抑制，使产生的不同靶序列单链产物拷贝数不一致，导致同一反应孔中不同靶序列的检测灵敏度明显不同，影响检测效果。因此，有必要寻求一种新的检测方法，能在一定程度上识别固定区域内的已知和未知位点突变情况，且检测特异性强、设计简单、成本低廉，同时操作简便、结果客观准确。有鉴于此，提出本专利技术。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的首要目的是提供一种基因多态性检测的方法及其应用。本专利技术的第二目的是提供一种用于检测高血压用药相关基因多态性的方法、试剂盒及其应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种检测基因多态性方法，所述方法包含：1)多重PCR引物和探针的设计；2)PCR扩增；3)熔解曲线分析。在一些实施方式中，所述1)多重PCR引物和探针的设计是针对多个靶序列分别设计上游引物、下游引物、标签引物和标记探针；所述上游引物或者下游引物中的一条由A区和B区构成：所述A区为靠近3’端段序列与靶序列完全互补；所述B区为靠近5’端连接一段与靶序列不同源的人工核苷酸序列，成为B区；另外一条引物与靶序列完全互补。在一些实施方式中，所述的标签引物与B区序列相同；优选的，所述标签引物GC含量30-50％，Tm值55-60℃；更优选的，针对多个靶序列的标签引物序列相同。。在一些实施方式中，所述探针与PCR扩增的单链产物序列互补，探针方向与标签引物方向相反。在一些优选的实施方式中，所述探针序列覆盖待检多态性位点区域，优选的与多态性位点纯合野生型序列相同或与之完全互补；在另一些优选的实施方式中，所述探针序列长度为20-30bp，Tm值45-75℃；在另一些优选的实施方式中，所述的探针为TaqMan探针，探针5’端标记荧光基团，选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY5等，3’端标记BHQ2；更优选的，不同靶序列的探针5’端标记不同的荧光基团，荧光基团与淬灭基团距离16-20个碱基。在一些实施方式中，所述2)PCR扩增为对称PCR扩增。在一些优选的实施方式中，所述上游引物和下游引物的终浓度相同，标签引物终浓度是上游引物及下游引物的3-30倍。在一些优选的实施方式中，PCR扩增中使用的聚合酶缺乏5’-3’端外切酶活性，避免水解探针。在一些实施方式中，所述3)熔解曲线分析是按1％速率进行升温使探针与PCR扩增的单链产物逐渐解链，形成熔解曲线。在一些实施方式中，所述基因多态性为高血压相关基因多态性。在一些优选的实施方式中，所述高血压相关基因多态性包括CYP2C9*3(rs1057910)/AGTR1(rs1801253)、ACE(rs4646994)和CYP2D6*10(rs1065852)/ADRB1(rs1801253)。在一些优选的实施方式中，针对CYP2C9*3(rs1057910)/AGTR1(rs1801253)的引物探针组包括：CYP2C9*3上游引物，序列为SEQIDNO.1；下游引物，序列为SEQIDNO.2；TaqMan探针，序列为SEQIDNO.3；AGTR1上游引物，序列为SEQIDNO.4；下游引物，序列为SEQIDNO.5；TaqMan探针，序列为SEQIDNO.6；标签引物，序列为SEQIDNO.7。SEQIDNO.1-7具体序列如下：CYP2C9*3上游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGCAGGAAGAGATTGAACGTG-3ˊSEQIDNO.1CYP2C9*3下游引物5`-GTCACAGGTCACTGCATG-3ˊSEQIDNO.2CYP2C9*3探针5`-FAM-TGGTGGGGAGAAGGTCAATGT-BHQ2-3ˊSEQIDNO.3AGTR1上游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGAAGAAGGAGCAAGAGAACATTC-3ˊSEQIDNO.4AGTR1下游引物5`-CTTTAGAAAAGTCGGTTCAGTC-3ˊSEQIDNO.5AGTR1探针5`-ROX-TCACTACCATATGAGCCTTAGCTA-BHQ2-3ˊSEQIDNO.6标签引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATG-3ˊSEQIDNO.7。在一些优选的实施方式中，所述针对ACE(rs4646994)的引物探针组包括：ACE上游引物，序列为SEQIDNO.8；下游引物，序列为SEQIDNO.9；TaqMan探针，序列为SEQIDNO.10；标签引物，序列为SEQIDNO.7。所述SEQIDNO.8-10具体序列如下：ACE上游引物5`-GAAGATCGGAGTCACCGTATGGCTGGAGAGCCACTCCC-3ˊSEQIDNO.8ACE下游引物5`-TCAGATCTGGTAGGGGTTTGA-3ˊSEQIDNO.9ACE探针5`-FAM-GCCTATACAGTCACTTGTATGTG-BHQ2-3ˊSEQIDNO.10。在一些优选的实施方式中，所述针对CYP2D6*10(rs1065852)/ADRB1(rs1801253)的引物探针组包括：CYP2D6*10上游引物，序列为SEQIDNO.11；下游引物，序列为SEQIDNO.12；TaqMan探针，序列为SEQIDNO.13；ADRB1(rs1801253)上游引物，序列为SEQIDNO.14；下游引物，序列为SEQIDNO.15；TaqMan探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测基因多态性方法，其特征在于，所述方法包含：/n1)多重PCR引物和探针设计，/n2)PCR扩增，/n3)熔解曲线分析；/n所述1)多重PCR引物和探针设计是针对多个靶序列分别设计上游引物、下游引物、标签引物和标记探针；/n所述上游引物或者下游引物中的一条由A区和B区构成：所述A区为靠近3’端序列与靶序列完全互补；所述B区为靠近5’端连接一段与靶序列不同源的人工核苷酸序列；另外一条引物与靶序列完全互补；/n所述标签引物与B区序列相同；/n所述探针与PCR扩增的单链产物序列互补，探针方向与标签引物方向相反；/n所述2)PCR扩增为对称PCR扩增。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测基因多态性方法，其特征在于，所述方法包含：
1)多重PCR引物和探针设计，
2)PCR扩增，
3)熔解曲线分析；
所述1)多重PCR引物和探针设计是针对多个靶序列分别设计上游引物、下游引物、标签引物和标记探针；
所述上游引物或者下游引物中的一条由A区和B区构成：所述A区为靠近3’端序列与靶序列完全互补；所述B区为靠近5’端连接一段与靶序列不同源的人工核苷酸序列；另外一条引物与靶序列完全互补；
所述标签引物与B区序列相同；
所述探针与PCR扩增的单链产物序列互补，探针方向与标签引物方向相反；
所述2)PCR扩增为对称PCR扩增。


2.权利要求1所述检测基因多态性方法，其特征在于，所述标签引物GC含量30-50％，Tm值55-60℃；优选的，针对多个靶序列的标签引物序列相同。


3.权利要求1-2任一所述检测基因多态性方法，其特征在于，所述探针序列与多态性位点纯合野生型序列相同或与之完全互补，探针序列长度为20-30bp，Tm值为45-75℃；优选的，探针5’端标记荧光基团，选自FAM、HEX、VIC、ROX或CY5，3’端标记BHQ2。


4.权利要求1-3任一所述检测基因多态性方法，其特征在于，所述2)PCR扩增中，上游引物和下游引物的终浓度相同，标签引物终浓度是上游引物及下游引物的3-30倍；更优选的，PCR扩增中使用的聚合酶缺乏5’-3’端外切酶活性，避免水解探针。


5.权利要求1-4任一所述检测基因多态性方法，其特征在于，所述3)熔解曲线分析按1％速率进行升温使探针与PCR扩增的单链产物逐渐解链，形成熔解曲线。


6.权利要求1-5任一所述检测基因多态性方法，其特征在于，所述基因多态性为高血压相关基因多态性；优选的，所述高血压相关基因多态性的检测位点包括CYP2C9*3(rs1057910)/AGTR1(rs1801253)、ACE(rs4646994)和CYP2D6*10(rs1065852)/ADRB1(rs1801253)；更优选的，针对所述检测位点的引物和探针序列如SEQIDNO.1-16所示。


7.一种用于基因多态性检测的引物探针组合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亚峰，李荣山，辛晓红，扶媛媛，苏正稳，王利，郝俊，杨颖，
申请(专利权)人：北京安智因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11