一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法，所述引物如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示，所述方法是以待检猪样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定。本发明专利技术的检测猪弓形虫病的引物可以特异性地扩增猪弓形虫，对其他常见病原无反应；方法具有很高的灵敏性，可以方便、快捷的对各种临床猪样本的猪弓形虫进行检测，有利于快速制定针对性的防控措施，操作简单、实用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，更具体地，本专利技术涉及一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
弓形虫病(Toxoplasmosis)是刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)引起的一种世界范围广泛分布的人兽共患病，宿主范围十分广泛，人及大多数动物感染率都较高。弓形虫病常导致动物流产、弱胎、死胎、生长受阻及死亡(王金苹.弓形虫病PCR和ELISA诊断方法的建立和初步应用.[硕士学位论文]，2005，华中农业大学；江涛.猪弓形虫病分子诊断方法的建立与基因免疫研究.[博士学位论文]，2006,华中农业大学)。猪弓形虫病是养猪生产中较为常见和多发的一种传染性寄生虫病。临床上以高热稽留、呼吸及神经系统异常为主要发病特征，发病急、传染性强，病死率较高。怀孕母猪感染发病后多发生流产或死胎。目前猪弓形虫病的检测方法主要为病原学诊断方法，包括病料直接镜检和病原分离。病原学诊断方法较为简单，结果可靠，但检出率低，耗时，容易漏诊，一般不能进行生前诊断。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种猪弓形虫病的检测方法，以及该检测方法所使用的引物，该引物可特异性扩增猪弓形虫，快速对临床样品进行检测。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种检测猪弓形虫病的引物，所述引物如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示。上述引物在制备检测猪弓形虫病的试剂盒中的应用。一种检测猪弓形虫病的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测猪弓形虫病的引物。一种检测猪弓形虫病的方法，采用上述引物，包括以下步骤：以待检猪样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定；所述PCR扩增反应的反应体系为：所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃5min进行预变性；然后94℃30s，55℃30s，72℃40s，35次循环；最后72℃延伸10min。与现有技术相比，本专利技术具有以下显著效果：1、本专利技术的检测猪弓形虫病的引物可以特异性地扩增猪弓形虫，对其他常见病原如猪附红细胞体、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌等无反应；2、本专利技术的检测猪弓形虫病的方法具有很高的灵敏性，灵敏度可达0.15ng左右，可以方便、快捷的对各种临床猪样本的猪弓形虫进行检测，有利于快速制定针对性的防控措施，操作简单、实用。附图说明图1为本专利技术实施例1中猪弓形虫病的临床样品检测，其中泳道1为猪弓形虫阳性对照，泳道2为猪弓形虫阴性对照，泳道3、4、5、6分别为临床样品；图2为本专利技术试验例1中猪弓形虫的PCR检测方法的特异性的电泳图谱，其中：泳道1为猪弓形虫阳性样品，泳道2为猪弓形虫阴性样品，泳道3-8分别为猪附红细胞体、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌样品；图3为本专利技术试验例2中猪弓形虫病的PCR检测方法的灵敏度的电泳图谱，其中泳道1、2、3、4、5、6、7的DNA浓度分别为0.149μg、0.0149μg、1.49ng、0.149ng、0.0149ng、1.49pg、0.149pg。具体实施方式以下结合附图和具体实施例来详细说明本专利技术。以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。实施例1检测猪弓形虫病的引物和方法1、引物设计根据NCBI登陆的猪弓形虫多拷贝B1基因序列(登录号：EU340881，KT266796，LN714499，KF413760，EU340874，AF179871)进行比对，并设计了一对特异性扩增猪弓形虫的引物，分别为F1、R1。F1：CCCTTACTGCAAGAGAAGT(SEQIDNO:1)R1：GCTGCTTGAAGAGAGACGCT(SEQIDNO:2)2、检测方法包括以下步骤：(1)待检猪样本基因组DNA提取采用爱思进生物技术(杭州)有限公司DNA/RNA小量试剂盒。200μL待检猪场采集的抗凝血(编号3)、100mg的猪肺脏(编号4)、淋巴结(编号5)、胸腔积液(编号6)病料分别加入1mLPBS缓冲液进行充分研磨,-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液200μL，转入1.5mL离心管中。加200μLBufferV-L，漩涡振荡混合均匀，静置5min。加75μLBufferV-N，漩涡振荡混合均匀，12000g离心5min。将上清转移到新的2mL离心管中，加300μL异丙醇(含1％冰醋酸)，上下倒置6-8次混匀。将制备管置于2ml离心管中，将混合液移入制备管中，8000g离心1min。弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加500μLBufferW1A，室温静置1min。12000g离心1min。弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加800μLBufferW2，12000g离心1min。将制备管置回到2mL离心管中，12000g离心1min。将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加入40μLBufferTE，室温静置1min。12000g离心1min，离心下来的溶液即为基因组DNA模板。(2)、PCR扩增将PCR反应液加入PCR反应管混合均匀后，加入基因组DNA模板，将PCR管置于PCR仪上进行循环扩增反应；PCR反应体系如下，其中PremixEXTaq是PCR反应用的DNAPolymerase、Buffer、dNTPMixture的2倍浓度的混合物，包含DNAPolymerase1.25U/25μL、Buffer(Tris-HCl,pH8.320mM，KCl100mM，MgCl23mM)、dNTPMixture各0.4mM：所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃5min进行预变性；然后94℃30s，55℃30s，72℃40s，35次循环；最后72℃延伸10min。(3)、电泳鉴定PCR扩增后取5μL反应产物，在1％(质量比)的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，PCR产物出现431bp条带，即为猪弓形虫阳性，无条带出现的为阴性，本实施例的猪样本检测结果见图1，猪样本4、6检测为阳性；猪样本3、5检测为阴性。试验例1特异性试验以猪附红细胞体、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌样品进行特异性检测。使用实施例1中所提供的方法和引物进行检测，结果显示，除阳性对照组外均没有扩增曲线，扩增结果<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测猪弓形虫病的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪弓形虫病的引物，其特征在于，所述引物如SEQIDNo:1和
SEQIDNo:2所示。
2.权利要求1所述的引物在制备检测猪弓形虫病的试剂盒中的应用。
3.一种检测猪弓形虫病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求
1所述的检测猪弓形虫病的引物。
4.一种检测猪弓形虫病的方法，其特征在于，采用如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋爽，欧阳海平，王晓飞，潘永飞，王东东，宋延华，
申请(专利权)人：广东温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44