一种葡萄酒中腐败酵母菌的检测引物及数字PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种葡萄酒中腐败酵母菌进行快速检测的检测引物及数字PCR检测方法。数字PCR反应体系含有特定引物Bret F、Bret R以及特有探针。数字PCR检测方法，检测方法为：提取葡萄酒样品中的DNA后进行数字PCR反应，数字PCR的反应体系适合于任何品种葡萄酒中提取得到的基因组样品，可以实现对一种葡萄酒中腐败酵母菌（布鲁塞尔酵母）基因片段进行精确检测。解决了现在酒中无快速检测标准方法及存在检测时间长且容易出现假阴性结果的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄酒中腐败酵母菌的检测引物及数字PCR检测方法
本专利技术涉及微生物的检测，具体涉及一种葡萄酒中腐败酵母菌的检测引物及数字PCR检测方法。
技术介绍
酒香酵母经常被认为是葡萄酒各种不良气味的诱因，可能导致葡萄酒变坏。由酒香酵母诱发的不良香气和风味主要来源于几种特殊化学物质，尤其是对乙基苯酚和4-乙基愈创木酚。一旦葡萄酒在发酵过程中产生这两种物质，它们就会与葡萄酒的其他物质进行结合，产生异味、异香。酒香酵母包含多种不同的酵母，其中包括常见的布鲁塞尔酒香酵母(B.bruxellensis)。市场上大约有30%的红酒可以检测到有布鲁塞尔酒香酵母的存在，布鲁塞尔酒香酵母存在于葡萄、葡萄酒、酿酒设备和橡木桶中。与酿酒酵母相比，布鲁塞尔酒香酵母对二氧化硫和酒精的耐受性更强，普通的处理手段很难将其完全除去。因此，布鲁塞尔酒香酵母是葡萄酒中最常发现的败坏酵母。布鲁塞尔酒香酵母可以利用葡萄酒中的对羟基肉桂酸，在羟基肉桂酸脱羧酶的作用下产生4-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚/4-乙基愈创木酚等代谢产物。过高浓度的4-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚/4-乙基愈创木酚会导致葡萄酒发出类似马汗的味道，俗称“马味”葡萄酒，严重影响葡萄酒的品质，因此，对葡萄酒中布鲁塞尔酒香酵母的检测十分重要。传统的检测方法是利用鉴别培养基进行分离检测。但是布鲁塞尔酒香酵母在葡萄酒尤其是瓶装葡萄酒中有时呈现一种存活但不可培养的状态。在此状态下，其仍可进行生理代谢，但不能生长繁殖。因此，直接涂布平板其不能生长，导致假阴性的检测结果。并且该方法检测时间过长，现在技术中也无快速检测布鲁塞尔酒香酵母的标准方法。国际上，法国几大酒庄，如波尔多大学下属的葡萄酒及葡萄园研究所，波亚克地区酒类专家实验室（拉菲产地）在生产、销售环节中均检测酒香酵母菌，把其作为企业内部监控红酒品质的一项重要指标；而目前国内对其还没有足够的重视。因此建立葡萄酒中布鲁塞尔酒香酵母的快速检测方法，在葡萄酒酿造、生产、装瓶前进行监控，防止布鲁塞尔酒香酵母数量超标，可以起到减少葡萄酒的变质，降低变质风险的作用；还可以从源头上减少能源和社会物质的浪费，提高葡萄酒品质，加强进出口贸易发展。因此，建立葡萄酒中布鲁塞尔酒香酵母菌的快速检验方法，改善国内对布鲁塞尔酒香酵母的检测现状，具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供一种葡萄酒中腐败酵母菌的检测引物及数字PCR检测方法。本专利技术的技术方案：检测方法为：一、提取葡萄酒样品中的DNA，裂解细胞并纯化DNA；二、数字PCR反应。本专利技术的进一步设置：数字PCR的反应体系包括：2×PCR反应液10.0μL上游引物(10μmol/L)1.0μL下游引物(10μmol/L)1.0μL探针Bret(10μmol/L)0.5μLDNA模板5.0μL超纯水2.5μL总体积20μL其中，上游引物：含有特定引物BretF，其序列为：5’-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3’；下游引物：含有特定引物BretR，其序列为：5’-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3’；探针Bret：含有探针Probe1，其序列为：5’-FAM-ATGGCGAGGATGAAAGTTTGGGATACA-BHQ1-3’。本专利技术的再进一步设置：数字PCR反应参数为：95℃预变性10min；95℃变性30sec，55℃退火延伸30sec，72℃30sec，50个循环；升温速度2℃~4℃保存反应产物。本专利技术的再更进一步设置：数字PCR检测方法在葡萄酒中布鲁塞尔酒香酵母检测的应用。本专利技术的有益效果是：解决了现在酒中无快速检测标准方法及存在检测时间长且容易出现假阴性结果的技术问题。数字PCR的反应体系适合于任何品种葡萄酒中提取得到的基因组样品，可以实现对布鲁塞尔酵母基因片段进行精确检测。采用数字PCR可以快速、特异定量地检测样品中的葡萄酒中腐败酵母菌，从样品DNA提取到数字PCR检测完成整个程序所花费时间至多也不超过6h，灵敏度可达3cfu/mL。可见，该方案可以快速、灵敏、准确地检出葡萄酒中的布鲁塞尔酒香酵母，该检测方法适合于各种葡萄酒样品的检测，对于改善国内对布鲁塞尔酒香酵母的检测现状具有重大意义。附图说明图1模拟样品的灵敏度实验。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细的说明。实施例1：样品中DNA的提取1、取45mL待分析葡萄酒样品，置于具有无菌螺旋塞的50mL试管中，在4℃离心5min，离心力为9300×g，弃去上清液。然后加入45mL10mmol/LTris-HClpH8.0洗涤残渣，涡旋振荡上述溶液，在4℃离心5min，离心力为9300×g，弃去上清液。轻微涡旋，使沉淀悬浮于残留液体中。2、DNA提取2.1细胞裂解向收集的沉淀悬浮液中加入0.3g玻璃珠，然后加入PVPP，使其最终的质量/体积比为1%。加入200μL溶液I和200μL抽提液。涡旋振荡上述溶液80s，然后置于-20℃冷却80s；重复上述涡旋冷却步骤3次。2.2纯化DNA1)加入200μLTE溶液，12000×g，离心5min。小心收集400μL的上层水相至新的离心管中。如果水相和有机相分离不充分，重复上述离心步骤。2)向离心管中加入1mL无水乙醇，颠倒混匀4-5次。15700×g，离心5min，弃上清。3)加入400μLTE溶液和30μL浓度为1μg/μL的RNaseA溶液，重悬沉淀。37℃温育5min。4)加入10μL浓度为4mol/L的醋酸铵溶液和1mL无水乙醇，颠倒混匀。5)12000×g，离心5min，弃上清。倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同位置吸干。6)沉淀干燥：打开离心管盖，48℃恒温干燥1h。7)向干燥后的离心管底部加入25μLTE，涡旋震荡后于4℃放置1h-18h(帮助DNA溶解)。室温下测定DNA含量。当DNA浓度为0.34μg/mL-340μg/mL，A260/A280比值在1.7～1.9之间时，适宜PCR扩增。实施例2：数字PCR反应1、PCR反应体系，见表1。表1数字PCR反应体系试剂名称试剂用量（µL）2×PCR反应液10.0上游引物(10μmol/L)1.0下游引物(10μmol/L)1.0探针Bret(10μmol/L)0.5DNA模板5.0超纯水2.5总体积202、PCR反应参数：95℃预变性10min；95℃变性30sec，55℃退火延伸30sec，72℃30sec，50个循环；升温速度2℃~4℃保存反应产物。实施例3：方法的灵敏度实验模拟样品：葡萄酒样品用快速检测样品中布鲁塞尔酒香酵母的试剂盒检测。试剂盒组成为：试剂A：DNA提取试剂；试剂B：PCR反应液，其中含有特定引物BretF，其序列为：5’-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3’。试剂C：PCR反应液，其中含有特定引物BretR，其序列为：5’-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3’。试剂D：PCR反应液，其中含有探针，其序列为：Probe15’-FAM-ATGGCGAGGATGAAAGTTTGGGATACA-BHQ1-3’。试剂E：2×PCR反应液（不含dUTP）。先用试剂A提取样品中的DNA，之后进行PCR反应，本文档来自技高网...

【技术保护点】
根据权利要求1所述的一种葡萄酒中腐败酵母菌的检测引物及数字PCR检测方法，其特征在于：检测方法为：一、提取葡萄酒样品中的DNA，裂解细胞并纯化DNA；二、数字PCR反应。

【技术特征摘要】
1.根据权利要求1所述的一种葡萄酒中腐败酵母菌的检测引物及数字PCR检测方法，其特征在于：检测方法为：一、提取葡萄酒样品中的DNA，裂解细胞并纯化DNA；二、数字PCR反应。2.根据权利要求1所述的一种葡萄酒中腐败酵母菌的检测引物及数字PCR检测方法，其特征在于：所述数字PCR反应的体系包括：2×PCR反应液10.0μL上游引物(10μmol/L)1.0μL下游引物(10μmol/L)1.0μL探针Bret(10μmol/L)0.5μLDNA模板5.0μL超纯水2.5μL总体积20μL其中，上游引物：含有特定引物BretF，其序列为：5’-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3’；下游引物：含有特定引...

【专利技术属性】
技术研发人员：王传现，刘夏，李晓虹，韩伟，付溥博，钱云开，申进玲，马强，韩超，邱德义，何宇平，张子龙，吴美琪，杨则彬，陈万金，
申请(专利权)人：上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海,31