环介导等温扩增多重耐药基因oqxAB的检测引物、检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及细菌基因检测技术领域，特别涉及环介导等温扩增多重耐药基因

Loop mediated isothermal amplification multiple resistance gene oqxAB detection primer, detection kit and detection method

The invention relates to the technical field of bacterial gene detection, in particular to the loop mediated isothermal amplification of a multidrug resistance gene

【技术实现步骤摘要】
环介导等温扩增多重耐药基因oqxAB的检测引物、检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及细菌基因检测
，特别涉及环介导等温扩增多重耐药基因oqxAB的引物，还涉及一种用环介导等温扩增方法检测多重耐药基因oqxAB的试剂盒，还涉及用环介导等温扩增方法检测多重耐药基因oqxAB的检测方法。
技术介绍
质粒编码的多重耐药外排泵oqxAB最早是在研究喹乙醇耐药机制时予以发现。2003年，丹麦科学家Sorensen等首次从猪的粪便样品分离的大肠杆菌中发现了介导喹乙醇耐药性的质粒pOLA52。2004年，Hansen等从pOLA52质粒上发现了对喹乙醇耐药的外排泵基因oqxAB。由于其耐药机制非常符合RND家族的主动外排泵特征，因此属于质粒介导的RND家族。Strahilevitz等研究发现，外排泵oqxAB基因可降低细菌对喹诺酮类药物的敏感性，因此将其归入质粒介导的喹诺酮类耐药机制（plasmid-mediatedquinoloneresistance，PMQR）中。Lars等研究表明，oqxAB不仅可以介导喹乙醇、喹诺酮类、氯霉素的耐药，其作用底物还包括洗必泰、西曲溴铵、三氯生等清洁剂、洗涤剂和消毒剂。另外研究中还发现，氟甲喹、卡巴氧、甲氧苄啶、四环素等药物的耐药现象也可以随着oqxAB基因而转移，分析原因表明oqxAB可以与其他药物的耐药基因共同转移。目前，oqxAB已经在世界各地广泛发现，如丹麦、韩国、瑞士、日本、美国等，并大多出现于肠杆菌科细菌中，如大肠杆菌、沙门氏菌和肺炎克雷伯菌中。在研究人源和动物源oqxAB基因时，有关研究结果已经证实，动物源和人源耐药菌株具有相同的耐药特征，并且来源于同一株克隆菌株。因此含有oqxAB的肠杆菌科细菌已威胁人类的健康，给临床治疗带来了巨大的挑战。对于多重耐药基因oqxAB的检测，目前的实验室诊断主要是基于PCR技术进行确证。但是PCR方法容易出现假阳性，并且检测成本高，操作比较复杂，检测时间长（一般需要2-3小时），这些都影响了临床携带oqxAB基因的检测结果。环介导等温扩增方法（LAMP）是近年来新兴的一种基因扩增方法，对仪器设备要求不高，只需要一个恒温水浴锅或金属浴就可以，成本低，且临床上容易做到，检测时间较短，不超过1个小时，为快速、准确诊断基因的一种新方法。环介导等温扩增方法已经广泛应用于检测细菌的领域，并有很多相关专利获得授权。目前国内外均未见使用LAMP方法检测多重耐药基因oqxAB的报道。
技术实现思路
为了解决PCR扩增容易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题，增补使用LAMP检测多重耐药基因oqxAB的空白，本专利技术提供了使用环介导等温扩增多重耐药基因oqxAB的引物。本专利技术建立了一种多重耐药基因oqxAB的LAMP检测方法，根据oqxAB基因保守区的6段序列提供了一对特异性内引物，一对特异性外引物和一对环引物。本专利技术还提供了检测多重耐药基因oqxAB的试剂盒。本专利技术还提供了检测多重耐药基因oqxAB的检测方法。本专利技术是通过以下措施实现的：一种环介导等温扩增多重耐药基因oqxAB的引物，由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，其核苷酸序列分别如下：外引物F3:5'-TGCGCGCGGAGTATCC-3'外引物B3：5'-GAACCTGCGCCTGATCC-3'内引物FIP：5'-TGTTTTCAACGCCGTTGATCGC-GGCGCCAACCCGAAAG-3'内引物BIP：5'-TACATGAAATCGGTCGCCGGC-TACCCGGGCGGAAGGT-3'环引物LF：5'-TGTTTTCAACGCCGTTGATCGC-3'环引物LB:5'-TACATGAAATCGGTCGCCGGC-3'其中，外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。一种检测多重耐药基因oqxAB的试剂盒，包括若干个装有反应液的LAMP反应管，其中每25μl反应液中含有：12.5μl2×等温反应缓冲液、1.0μlBstDNA聚合酶、40pmol内引物FIP、40pmol内引物BIP、5pmol外引物F3、5pmol外引物B3、20pmol环引物LF、20pmol环引物LB，余量为灭菌双蒸水；其中BstDNA聚合酶的活性单位为8U/μl。2×等温反应缓冲液中含有40mMpH为8.8的Tris-HCl、20mMKCl、16mMMgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.2%wt%Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mMdNTP。所述的试剂盒，还包括1μl钙黄绿素。一种检测多重耐药基因oqxAB的检测方法，包括以下步骤：（1）提取待检测细菌基因组总DNA。（2）使用所述的试剂盒进行检测，具体操作为：将待检细菌基因组DNA加入LAMP反应管的反应液中，混匀，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照中加入反应液内的为含有oqxAB多重耐药基因的基因组DNA，阴性对照中加入反应液内的为灭菌双蒸水。将LAMP反应管置于水浴锅中进行扩增，扩增条件为：65℃水浴恒温反应45min。步骤（2）中待检细菌基因组DNA为含DNA的浓度为0.003-300ng/μl的DNA溶液。所述的检测方法，LAMP反应管中出现白色沉淀的为阳性结果，不出现白色沉淀的为阴性结果。所述的检测方法，其特征是在扩增反应前的反应管中加入1μl的钙黄绿素，反应结束后扩增产物变为绿色的是阳性结果，橙色的是阴性结果。步骤（1）中提取的待检细菌基因组DNA包括以下步骤：将待检的细菌菌株过夜培养后，取1ml的菌液12000rpm离心2min，彻底弃去上清。取沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA，最后溶于50μl灭菌双蒸水中，测定细菌基因组DNA的浓度为52ng/μl左右，-20℃保存备用。本专利技术的有益效果：1、采用LAMP技术，特异性强，比PCR检测方法灵敏度高，不需要昂贵的PCR仪器，只需要普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，通过肉眼观察白色沉淀或使用荧光染料显色肉眼直接观察即可判定结果，时间大大缩短，从普通PCR仪器的2-3h缩短至45min左右，简单而快速，可广泛应用于兽医及人医领域包括实验室及临床基层对多重耐药基因oqxAB的快速检测；2、解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷；3、具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，适于现场快速检测的优点。附图说明图1为实施例3中普通PCR方法检测oqxAB基因灵敏度检测结果。其中1-7号管中加入的为倍比稀释的含有oqxAB的大肠杆菌基因组DNA，8号管为阴性对照。其中1-7号管的基因组DNA浓度分别为52ng/μl、5.2ng/μl、0.52ng/μl、5.2*10-2ng/μl、5.2*10-3ng/μl、5.2*10-4ng/μl、5.2*10-5ng/μl。结果显示：1-4号能扩增到目的条带，为阳性；5-8号没有扩增到肉眼可见的目的条带，为阴性。图2为实施例3中LAMP方法检测oqxAB基因灵敏度检测结果。1-7号管中加入的为倍比稀释的含有oqxAB的大肠杆菌基因组DNA，8号管为阴性对照。其中1-7号管的基因组DNA浓度分别为52ng/μl、5.2ng/μl、0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环介导等温扩增多重耐药基因

【技术特征摘要】
1.一种环介导等温扩增多重耐药基因oqxAB的引物，其特征在于由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，碱基序列如下：外引物F3:5'-TGCGCGCGGAGTATCC-3'，外引物B3：5'-GAACCTGCGCCTGATCC-3'，内引物FIP：5'-TGTTTTCAACGCCGTTGATCGCGGCGCCAACCCGAAAG-3'，内引物BIP：5'-TACATGAAATCGGTCGCCGGCTACCCGGGCGGAAGGT-3'，环引物LF：5'-TGTTTTCAACGCCGTTGATCGC-3'，环引物LB:5'-TACATGAAATCGGTCGCCGGC-3'。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于外引物与内引物的摩尔比为1:8，外引物与环引物的摩尔比为1:4。3.一种检测多重耐药基因oqxAB的试剂盒，其特征在于含有若干个装有反应液的LAMP反应管，其中每25μl反应液中含有：12.5μl2×等温反应缓冲液、1.0μlBstDNA聚合酶、40pmol内引物FIP、40pmol内引物BIP、5pmol外引物F3、5pmol外引物B3、20pmol环引物LF、20pmol环引物LB，余量为灭菌双蒸水。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于BstDNA聚合酶的活性单位为8U/μl；2×等温反应缓冲液中含有40mMpH为8.8的Tris-HCl、20mMKCl、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李璐璐，刘玉庆，刘玲红，胡明，齐静，张庆，骆延波，张印，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37