一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法技术

一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法，采用更为敏感的巢式PCR方法，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，通过在基因水平上进行蜱虫的分型、系统进化分析，本发明专利技术巢式PCR方法第一轮只需10个循环，第二轮需25个循环，缩短了简单的两轮普通PCR所需时间。

【技术实现步骤摘要】
一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法
本专利技术具体涉及生物学
，具体涉及一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法。
技术介绍
蜱类是一种专性、非永久性寄生于陆生脊椎动物的医学节肢动物，可通过直接叮咬和释放毒素或携带病原体对宿主造成伤害。在进出境口岸蜱种类的调查中，对蜱虫的鉴定及进化分型具有重要意义。目前，我国对于蜱种的鉴定主要依靠形态学方法，还没有简单、稳定的分子生物学手段。
技术实现思路
为了解决现有技术的缺陷及不足，本专利技术提供了一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法，能够在低DNA模板浓度下快速、稳定的鉴定蜱虫的种类。本专利技术采用的技术解决方案是：一种蜱虫巢式PCR特异性引物，包括设计的两对特异性引物，具体为：T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。一种蜱虫巢式PCR鉴定方法，包括以下步骤：(1)将需要检测的蜱虫样品进行形态学上初步分型；(2)将经过形态学初步分型鉴定处理后的蜱虫样品，每种各取一只，进行基因组提取DNA，蜱虫样品无需RNA酶处理；(3)以蜱虫样品基因组DNA为模板，以所述的T18sF1+T18sR1为第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loadingbuffer、双蒸水，进行第一轮PCR；(4)以第一轮PCR产物DNA为模板，分别以所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1为第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loadingbuffer、双蒸水，进行第二轮PCR；(5)取第二轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(6)将第二轮PCR产物进行序列测定；(7)根据NCBI数据库中记载的蜱虫18srRNA基因序列，进行系统进化分析，最终得出蜱虫样品鉴定结果。所述的步骤(3)中的第一轮PCR反应条件为：预热95℃，5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，共10个循环；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。所述的步骤(4)中的第二轮PCR反应条件为：预热95℃，5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，共25个循环；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。所述的步骤(3)中蜱虫样品基因组DNA量为2μl，第一套引物中T18sF1+T18sR1各为1μl，LAtaq酶为0.25μl，dNTP为2μl，10×Loadingbuffer为2.5μl，双蒸水16.25μl。所述的步骤(4)中第一轮PCR产物DNA量为1μl，第二套引物T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1各为1μl，LAtaq酶为0.25μl，dNTP为2μl，10×Loadingbuffer为2.5μl，双蒸水17.25μl。所述的步骤(5)中第二轮PCR产物量为2μl。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法，采用更为敏感的巢式PCR方法，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，通过在基因水平上进行蜱虫的分型、系统进化分析，本专利技术巢式PCR方法第一轮只需10个循环，第二轮需25个循环，缩短了简单的两轮普通PCR所需时间。附图说明图1为18srRNA巢式PCR方法克隆示意图。图2为温州口岸进口生牛皮中截获蜱虫形态学观察。图3为两轮轮PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定结果。图4为根据18srRNA基因序列对蜱虫进行系统进化分析结果。具体实施方式根据蜱虫18srRNA序列保守区设计两对特异性引物T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。巢式PCR具体步骤(1)蜱虫温州口岸进口生牛皮中截获蜱虫，形态学上进行初步分型。(2)提取蜱虫基因组形态学鉴定后，每一种蜱虫取一只，按照基因组提取试剂盒(ZYMOL)说明进行基因组提取DNA，样品无需RNA酶处理。(3)克隆策略克隆分两步，按照图1所示，①以蜱虫基因组DNA为模板(2μl)，以T18sF1+T18sR1为第一套引物(各1μl)，LAtaq酶(0.25μl)，dNTP(2μl)，10×Buffer(2.5μl)，ddH2O(16.25μl)进行第一轮PCR，PCR程序为：②以第一轮PCR产物DNA为模板(1μl)，分别以T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1为第二套引物(各1μl)，LAtaq酶(0.25μl)，dNTP(2μl)，10×Buffer(2.5μl)，ddH2O(17.25μl)进行第一轮PCR，PCR程序为：(4)PCR产物鉴定取第二轮PCR产物2μl进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。(5)测序将第二轮PCR产物送测序公司进行序列测定。(6)根据18srRNA基因序列进行基因型分析在NCBI数据库中下载蜱虫18srRNA基因序列，通过MEGA5.0软件，进行系统进化分析实验结果1、截获蜱虫形态学观察根据形态学观察，将所截获蜱虫分成10种，命名为T1～T10，如图2所示。2、提取蜱虫基因组每种蜱虫取一只，按照基因组提取试剂盒(ZYMOL)说明进行基因组提取DNA，所提基因组DNA浓度为50～100ng/μl。3、巢式PCR结果以所获得的蜱虫基因组DNA为模板，经两轮PCR，通过琼脂糖凝胶电泳初步鉴定产物，如图3所示。以T18sF1+T18sR1为第一套引物，进行PCR，结果显示T3、T4、T5、T8、T10均出现目的条带，但其余5种蜱虫未出现扩增产物条带，如图3a；以第一轮产物为模板，进行第二轮巢式PCR后，10种测试样品均出现目的条带，如图3b。将克隆产物送公司进行测序。4、根据18srRNA基因序列进行基因型分析测序产物，通过拼接后，为18srRNA基因序列。与NCBI中已公布的蜱虫18srRNA基因序列进行比对分析，通过MEGA5.0软件，进行系统进化分析，结果表明，T1、T2、T3、T4、T8可能为Amblyomma或Aponomma的亚种；T5、T9与Boophilus和Rhipicephalus序列相似性为100％；T6、T10为Boophilus和Rhipicephalus的亚种，如图4所示。本专利技术通过建立了更为敏感的巢式PCR方法。单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定。现有技术对于蜱虫的分型主要通过形态学观察，本专利技术是在基因水平上进行蜱虫的分型、系统进化分析，与形态学方法具有本质的区别。本专利技术中，巢式PCR方法第一轮只需10个循环，第二轮需25个循环，缩短了简单的两轮普通PCR所需时间。以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，本专利技术的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本专利技术思路下的技术方案均属于本专利技术的保护范围。应当指出，对于本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜱虫巢式PCR特异性引物，其特征在于，包括设计的两对特异性引物，具体为：T18sF1：5`‑GTAGTCATATGCTTGTCTC‑3`；T18sR1：5`‑TCCGCAGGTTCACCTACGGA‑3`；T18sF2：5`‑CAARTGTCTGCCYTATCAACT‑3`；T18sR2：5`‑CTTCCGTCAATTCCTTTAAG‑3`。

【技术特征摘要】
1.一种蜱虫巢式PCR特异性引物，其特征在于，包括设计的两对特异性引物，具体为：T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。2.一种采用权利要求1所述的特异性引物的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将需要检测的蜱虫样品进行形态学上初步分型；(2)将经过形态学初步分型鉴定处理后的蜱虫样品，每种各取一只，进行基因组提取DNA，蜱虫样品无需RNA酶处理；(3)以蜱虫样品基因组DNA为模板，以权利要求1中所述的T18sF1+T18sR1为第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loadingbuffer、双蒸水，进行第一轮PCR；(4)以第一轮PCR产物DNA为模板，分别以权利要求1中所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1为第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loadingbuffer、双蒸水，进行第二轮PCR；(5)取第二轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；(6)将第二轮PCR产物进行序列测定；(7)根据NCBI数据库中记载的蜱虫18srRNA基因序列，进行系统进化分析，最终得出蜱虫样品鉴定结果。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王素华，闫宝龙，帅江冰，吴绍强，
申请(专利权)人：温州出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：浙江,33