用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种可用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物，特异性引物包括上游引物MeJB3 F和下游引物MeJB4.5 R，MeJB3 F的核苷酸序列为：5'‑TGAAAGAATTCATGAATTGAAAACG‑3'，MeJB4.5 R的核苷酸序列为：5'‑AGATTTCATATTGTATTTAATTTTTG‑3'。本发明专利技术还提供一种可用于检测猪长刺后圆线虫的检测试剂盒，检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及引物混合液，引物混合液包括前述的特异性引物。本发明专利技术还提供一种前述的特异性引物在检测猪长刺后圆线虫的应用。本发明专利技术提供的特异性引物和检测试剂盒具有特异性高、检测效率高、保存时间长的特点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物及其应用
本专利技术属于基因检测
，尤其涉及一种用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物及其应用。
技术介绍
猪后圆线虫为圆形目、后圆科、后圆属，是猪长刺后圆线虫、复阴后圆线虫、萨姆氏后圆线虫3种后圆线虫的总称，猪后圆线虫病是一种由线虫寄生于猪支气管和细支气管的线虫病，由于虫体呈丝状，寄生于肺脏，故又称猪肺丝虫病或肺线虫病。猪后圆线虫对羊、牛、猪均易感，偶见于羊、鹿、牛和其他反刍兽，亦偶见于人，主要发生在幼猪，死亡率较高，危害较大。猪肺丝虫病呈地方性流行，在河谷区和低热区多发。在我国，江西省猪后圆线虫病感染率为40％，辽宁省为59.81％，湖南省为5.93％，河北省为18.5％，江苏省为43.6％，四川省为20.7，并呈明显的逐年上升趋势。对猪后圆线虫病的准确诊断是有效防控此病的前提，现有的检测方法主要根据临床症状、流行病学情况、病理变化、进行初步诊断，并进一步结合粪便检查虫卵进行确诊，虽然现有检测方法简单易行，对成虫有一定的准确性，但对于形态上难以区分种类。特别是各种线虫在虫卵和幼虫阶段难以区分，而且猪长刺后圆线虫、猪复阴后圆线虫、猪萨姆氏后圆线虫3种后圆线虫彼此也难以区分，同时现有的检测方法检测效率、检测准确性较低、检测结果受检测人员经验影响大。因此，有必要对现有猪长刺后圆线虫检测做进一步开发，提供一种检测方法检测效率高、检测准确性高、检测结果受检测人员经验影响小的检测试剂盒及其使用方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种可用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物及其应用，其具有检测结果准确、检测效率高的优点。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：本专利技术提供一种可用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物MeJB3F和下游引物MeJB4.5R，所述MeJB3F的核苷酸序列为：5'-TGAAAGAATTCATGAATTGAAAACG-3'；所述MeJB4.5R的核苷酸序列为：5'-AGATTTCATATTGTATTTAATTTTTG-3'。通过比对多种猪后圆线虫cox1基因，针对较稳定保守区设计所述MeJB3F和MeJB4.5R，预期扩增片段大小约为400bp左右。引物序列中G+C含量为40％～60％，上下游引物不存在二级结构，互配可能性低，引物具有特异性。本专利技术还提供一种可用于检测猪长刺后圆线虫的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及引物混合液，所述引物混合液包括上述的特异性引物。上述猪长刺后圆线虫的检测试剂盒，还包括阳性对照液，所述阳性对照液包括猪长刺后圆线虫DNA。上述猪长刺后圆线虫的检测试剂盒，所述DNA裂解液主要由100mMNaCl70μl、pH值为8.0的10mMTris-Cl30μl、pH值为8.0的25mMEDTA150μl、1％W/V十二烷基硫酸钠30μl和1.7μg/μL蛋白酶K200μl组成。所述DNA裂解液采用适宜的比例配置，避免资源浪费。上述的检测试剂盒，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、25mMMgCl2溶液和2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液。上述的检测试剂盒，所述引物混合液中所述MeJB3F和MeJB4.5R的浓度均为100pmol/μL。本专利技术还提供一种如上述的特异性引物在检测猪长刺后圆线虫的应用。上述的应用，利用所述特异性引物制成检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及引物混合液，所述引物混合液包括所述特异性引物，所述检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)DNA的提取：取待测虫体样品用双蒸水反复吹打冲洗，移去双蒸水，加入DNA裂解液置于37～55℃温箱中16-18h，再提取DNA，制备得到样品DNA；(2)PCR扩增：取灭菌ddH2O、PCR反应液、Taq酶和引物混合液按适合的PCR反应体系加入离心管中，混匀后分装放入多个离心管中制得多份分装液，取步骤(1)制备的样品DNA，每一样品DNA对应加入一份分装液中并标号，混匀，置于PCR扩增仪上按适合的PCR扩增条件反应，制得PCR扩增产物；(3)PCR产物观察：取步骤(2)制备的PCR扩增产物依标号加样于1.0％琼脂糖凝胶上，120～130V电压电泳20～40分钟后，置于紫外透射仪下观察是否出现条带，若存在400bp～410bp大小的条带，则待测虫体样品为猪长刺后圆线虫；若不存在400bp～410bp大小的条带，则待检测虫体样品不是猪长刺后圆线虫。上述的检测试剂盒的使用方法，所述步骤(2)中PCR反应体系为PCR缓冲液2～3μL、25mM的MgCl2溶液3～4μL、2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液2μL、5U/μL的Taq酶0.25～0.3μL、样品DNA、引物混合液0.8～1.2μL，余量为灭菌ddH2O补至25μL。上述的检测试剂盒的使用方法，所述步骤(2)中PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec、52～58℃退火30sec、72℃延伸30sec，共38个循环；72℃延伸5min。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1、通过设计MeJB3F和MeJB4.5R可以有效扩增出目的片段，从而检测出猪长刺后圆线虫，同时对同属的猪复阴后圆线虫和猪萨姆氏后圆线虫无反应，从基因层面上相区别；2、检测试剂盒的特异性高、检测准确、检测效率高；3、通过检测试剂盒的使用方法，可以扩增出清晰的条带，用于检测分析，且操作一致性高；4、检测试剂盒本身便于运输、存放保质时间长。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1，为使用本专利技术提供的检测试剂盒一较佳实施例的PCR扩增产物电泳图；图2，为本专利技术提供的检测试剂盒用于检测不同线虫一较佳实施例的PCR扩增产物电泳图；图3，为本专利技术提供的检测试剂盒存放10个月后制备的PCR扩增产物电泳图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文专利技术做更全面、细致地描述，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本专利技术的保护范围。除非另有特别说明，本专利技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。除非另有特别说明，本专利技术中用到DNA提取试剂盒为普洛麦格(北京)生物技术有限公司提供的WizardTMDNAClean-UpSystem。实施例1本专利技术提供一种可用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物，特异性引物包括上游引物MeJB3F和下游引物MeJB4.5R，MeJB3F的核苷酸序列为：5'-TGAAAGAATTCATGAATTGAAAACG-3'；MeJB4.5R的核苷酸序列为：5'-AGATTTCATATTGTATTTAATTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物MeJB3F和下游引物MeJB4.5R，所述MeJB3F的核苷酸序列为：5'‑TGAAAGAATTCATGAATTGAAAACG‑3'；所述MeJB4.5R的核苷酸序列为：5'‑AGATTTCATATTGTATTTAATTTTTG‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种可用于检测猪长刺后圆线虫的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物MeJB3F和下游引物MeJB4.5R，所述MeJB3F的核苷酸序列为：5'-TGAAAGAATTCATGAATTGAAAACG-3'；所述MeJB4.5R的核苷酸序列为：5'-AGATTTCATATTGTATTTAATTTTTG-3'。2.一种可用于检测猪长刺后圆线虫的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解液、对样品DNA进行扩增的PCR反应液、以及引物混合液，所述引物混合液包括如权利要求1所述的特异性引物。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照液，所述阳性对照液包括猪长刺后圆线虫DNA。4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA裂解液主要由100mMNaCl70μl、pH值为8.0的10mMTris-Cl30μl、pH值为8.0的25mMEDTA150μl、1％W/V十二烷基硫酸钠30μl和1.7μg/μL蛋白酶K200μl组成。5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、25mMMgCl2溶液和2.0mM脱氧核糖核苷酸溶液。6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物混合液中，所述MeJB3F和MeJB4.5R的浓度均为100pmol/μL。7.一种如权利要求1所述的特异性引物在检测猪长刺后圆线虫的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用所述特异性引物制成检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于对样品DNA进行裂解的DNA裂解...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟，刘雪松，谭磊，尹德明，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43